ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 रासायनिक उद्योग रासायनिक घटकांसाठी डुप्लेक्स वेल्डेड ट्यूब , SPECC1L च्या कमतरतेमुळे स्प्लिस केलेल्या सांध्याची स्थिरता वाढते आणि क्रॅनियल न्यूरल क्रेस्ट पेशींची कमी कमी होते.

Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद.तुम्ही मर्यादित CSS समर्थनासह ब्राउझर आवृत्ती वापरत आहात.सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये सुसंगतता मोड अक्षम करा).याव्यतिरिक्त, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही शैली आणि JavaScript शिवाय साइट दर्शवतो.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 रासायनिक उद्योगासाठी डुप्लेक्स वेल्डेड ट्यूब

लियाओचेंग सिहे एसएस मटेरियल कं, लि.स्टेनलेस स्टील सीमलेस पाईप्स, ब्राइट अॅनिल ट्युब्स, सीमलेस कॉइलेड टयूबिंग इ.ग्राहकांच्या सोयीसाठी, आमच्याकडे वेल्डेड पाईप्स आणि ट्यूब्स आहेत.लियाओचेंग सिहे एसएस मटेरियल कं, लि.सर्वात प्रगत उत्पादन आणि चाचणी उपकरणे आहेत.आम्ही तुमच्या गरजा पूर्णपणे पूर्ण करू शकतो.अत्यंत काटेकोरपणे मानकांनुसार, आमच्याद्वारे उत्पादित केलेल्या नळ्यांमध्ये नेहमी योग्य OD आणि WT सहिष्णुता असते.सहिष्णुता नियंत्रण काटेकोरपणे उत्पादन मानकांनुसार आहे.आमची उत्पादने नेहमीच ग्राहकांशी समाधानी असतात.ग्राहकांनी आमची उत्पादने खरेदी केल्याने अधिक नफा कमावला.
अ) OD (बाह्य व्यास): 3.18 मिमी ते 101.6 मिमी
b) WT (भिंतीची जाडी): 0.5 मिमी ते 20 मिमी
c) लांबी: ग्राहकाच्या गरजेनुसार
ड) मानके : ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 इ
e) प्रक्रिया पद्धत : ERW, EFW इ

प्रति स्लाइड तीन लेख दर्शवणारे स्लाइडर.स्लाइड्समधून जाण्यासाठी मागील आणि पुढील बटणे वापरा किंवा प्रत्येक स्लाइडमधून जाण्यासाठी शेवटी स्लाइड कंट्रोलर बटणे वापरा.
क्रॅनियल न्यूरल क्रेस्ट सेल्स (CNCC) भ्रूण न्यूरल फोल्ड्स बंद करतात आणि घशाच्या कमानीकडे स्थलांतर करतात, जे बहुतेक मध्यभागी संरचना बनवतात.सीएनसीसी डिसफंक्शन ऑरोफेसियल क्लेफ्टच्या एटिओलॉजीमध्ये महत्त्वाची भूमिका बजावते, एक सामान्य जन्मजात विकृती.हेटरोझिगस SPECC1L उत्परिवर्तन अॅटिपिकल आणि सिंड्रोमिक क्लेफ्ट्स असलेल्या रुग्णांमध्ये आढळले आहेत.येथे, आम्‍ही संस्‍कृत SPECC1L नॉकडाउन सेल्‍समध्‍ये कॅनोनिकल अॅडेसिव्ह जंक्‍शन (AJ) घटक, β-catenin आणि E-cadherin च्‍या वर्धित स्‍टेनिंगचा अहवाल देतो आणि इलेक्ट्रॉन मायक्रोग्राफ AJ चे एपिकल-बेसल डिफ्यूजन दाखवतात.क्रॅनिओफेशियल मॉर्फोजेनेसिसमध्ये SPECC1L ची भूमिका समजून घेण्यासाठी, आम्ही एक Specc1l कमतरता असलेले माउस मॉडेल तयार केले.होमोजिगस उत्परिवर्ती भ्रूण प्राणघातक असतात आणि न्यूरल ट्यूब बंद होणे आणि CNCC लॅमिनेशन प्रदर्शित करतात.म्युटंट न्यूरल फोल्ड्समध्ये एजे प्रोटीन स्टेनिंग वाढले आहे.हा AJ दोष CNCC delamination मधील दोषाशी सुसंगत आहे, AJ विघटन आवश्यक आहे.याव्यतिरिक्त, Specc11 उत्परिवर्तनांनी PI3K-AKT सिग्नलिंग कमी केले आहे आणि ऍपोप्टोसिस वाढले आहे.इन विट्रो, जंगली-प्रकारच्या पेशींमध्ये PI3K-AKT सिग्नलिंगचे सौम्य प्रतिबंध AJ बदलांना प्रेरित करण्यासाठी पुरेसे होते.महत्त्वाचे म्हणजे, SPECC1L नॉकडाउनद्वारे प्रेरित AJ बदल PI3K-AKT मार्ग सक्रिय करून उलट केले जाऊ शकतात.एकत्रितपणे, हे डेटा सूचित करतात की SPECC1L, PI3K-AKT सिग्नलिंग आणि AJ जीवशास्त्राचे नवीन नियामक म्हणून, न्यूरल ट्यूब क्लोजर आणि CNCC स्तरीकरणासाठी आवश्यक आहे.
क्रॅनियल न्यूरल क्रेस्ट सेल्स (CNCCs) पृष्ठीय न्यूरोएक्टोडर्ममध्ये स्थानिकीकरण करतात आणि एपिथेलियल-मेसेन्कायमल संक्रमण (EMT) 1,2,3 चा समावेश असलेल्या प्रक्रियेद्वारे विकसनशील न्यूरल फोल्ड्सच्या न्यूरोएपिथेलियमपासून वेगळे होतात.प्रिमिग्रेटिंग एपिथेलियल सीएनसीसी इंटरसेल्युलर जंक्शन्समध्ये व्यत्यय आणतात आणि स्थलांतरित मेसेन्कायमल सीएनसीसी बनतात जे प्रथम आणि द्वितीय फॅरेंजियल कमानी भरतात आणि बहुतेक क्रॅनिओफेशियल कूर्चा तयार करतात.अशाप्रकारे, CNCC फंक्शनचे नियमन करणारी जीन्स बहुतेक वेळा क्रॅनिओफेसियल जन्मजात विसंगतींच्या एटिओलॉजीमध्ये व्यत्यय आणतात जसे की ओरोफेसियल क्लेफ्ट्स, सर्वात सामान्यपणे एकट्या यूएस मध्ये 1/800 जन्मांवर परिणाम करतात.जन्मजात विकृतींपैकी एक 8.
CNCC चे डिलेमिनेशन हे उंदरांमध्ये भ्रूण विकासाच्या 8.5 ते 9.5 दिवसांच्या दरम्यान अँटीरियर न्यूरल ट्यूब बंद होण्याशी जुळते.अनेक माऊस ओरोफेसियल क्लेफ्ट-संबंधित जीन्सचे उत्परिवर्ती देखील काही प्रकारचे न्यूरल ट्यूब दोष प्रदर्शित करतात, ज्यात Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 आणि Pdgfrα12 समाविष्ट आहेत.तथापि, न्यूरल ट्यूब क्लोजर आणि CNCC स्तरीकरणाच्या प्रक्रिया स्वतंत्र मानल्या जाऊ शकतात, कारण Splotch mutant mouse (Pax3) CNCC स्तरीकरण किंवा स्थलांतर 13,14 वर कोणताही परिणाम न होता न्यूरल ट्यूब बंद होण्यामध्ये दोष प्रदर्शित करते.CNCC विच्छेदन आणि न्यूरल ट्यूब क्लोजरमध्ये दोष असलेले अतिरिक्त माउस मॉडेल या दोन प्रक्रियांचा सामान्य आण्विक आधार रेखाटण्यात मदत करतील.
न्यूरोएपिथेलियल पेशींपासून CNCC च्या अलगावसाठी चिकट जंक्शन्स (AJs) चे विघटन करणे आवश्यक आहे, जे प्रोटीन कॉम्प्लेक्सचे बनलेले असतात, इतरांमध्ये, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, आणि α-actinin ऍक्टिन फिलामेंट्स 2 शी संबंधित असतात. न्यूरल फोल्ड्समधील ई-कॅडेरिनच्या ओव्हरएक्सप्रेशन अभ्यासाने CNCC डिलेमिनेशनमध्ये घट किंवा विलंब दर्शविला.याउलट, E-cadherin च्या दडपशाहीचा परिणाम लवकर स्तरीकरण 15,16 मध्ये होतो.CNCC स्तरीकरणादरम्यान EMT मध्ये मध्यस्थी करणारे अनेक घटक म्हणजे ट्रान्सक्रिप्शन घटक (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) आणि एक्स्ट्रासेल्युलर मॅट्रिक्स (ECM) रीमॉडेलिंग प्रथिने जसे की मॅट्रिक्स मेटालोप्रोटीनेसेस (MMPs), तथापि CNCC थेट cytoskeleators आहेत. अद्याप माहित नाही.PI3K-AKT मार्ग मुख्यत्वे कर्करोग संशोधन17 पासून, ई-कॅडेरिन पातळीचा विरोध करण्यासाठी ओळखला जातो.अलीकडील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की उंदरांमध्ये PDGFα-आधारित PI3K-AKT सिग्नलिंग कमी झाल्यामुळे क्रॅनिओफेशियल विकृती निर्माण होतात, ज्यात क्लॅफ्ट पॅलेट आणि न्यूरल ट्यूब दोष 12 यांचा समावेश होतो.तथापि, CNCC स्तरीकरणावर PI3K-AKT मार्ग आणि AJ स्थिरता यांच्यातील संबंध अस्पष्ट आहे.
तोंडापासून डोळ्यापर्यंत पसरलेल्या गंभीर फाटलेल्या दोन लोकांमध्ये SPECC1L हे पहिले उत्परिवर्ती जनुक म्हणून ओळखले जाते, ज्याला तिरकस फाट (ObFC) किंवा Tessier IV18 cleft म्हणून ओळखले जाते.SPECC1L उत्परिवर्तन दोन बहुजनीय कुटुंबांमध्ये ऑटोसोमल डोमिनंट Opitz G/BBB सिंड्रोम (OMIM #145410) सह ओळखले गेले आहेत, ज्यामध्ये प्रभावित व्यक्तींमध्ये हायपरडिस्टन्स आणि क्लेफ्ट लिप/पॅलेट19 दिसून आले आणि टिबी ओव्हरडिस्टन्स सिंड्रोम असलेल्या एका कुटुंबात (OMIM #1425) .Opitz G/BBB सिंड्रोमची अर्ध्याहून अधिक प्रकरणे एक्स-लिंक्ड (OMIM #300000) आहेत आणि MID1 जनुकातील उत्परिवर्तनामुळे होतात, जी मायक्रोट्यूब्यूल-संबंधित सेल स्केलेटनच्या प्रोटीन 22 ला एन्कोड करते.आम्ही असे गृहित धरतो की SPECC1L, मायक्रोट्यूब्यूल्स आणि ऍक्टिन सायटोस्केलेटनशी संबंधित एक प्रथिने देखील सेल आसंजन आणि स्थलांतर 18 दरम्यान ऍक्टिन साइटोस्केलेटन रीमॉडेलिंगसाठी आवश्यक सिग्नलिंगमध्ये मध्यस्थी करू शकते.इन विट्रो आणि व्हिव्हो अभ्यासांद्वारे, आम्ही आता PI3K-AKT सिग्नलिंगद्वारे AJ स्थिरतेचे नवीन नियामक म्हणून SPECC1L चे वर्णन करतो.सेल्युलर स्तरावर, SPECC1L च्या कमतरतेमुळे पॅन-AKT प्रोटीनची पातळी कमी झाली आणि AJ च्या apical-basal dispersion मध्ये वाढ झाली, जी AKT मार्गाच्या रासायनिक सक्रियतेने काढून टाकली गेली.विवोमध्ये, स्पेक 11- कमतरतेचे भ्रूण न्यूरल ट्यूब बंद होणे आणि CNCC विच्छेदन कमी करणे दर्शविते.अशा प्रकारे, SPECC1L चेहर्यावरील मॉर्फोजेनेसिस दरम्यान सामान्य CNCC फंक्शनसाठी आवश्यक असलेल्या उच्च नियंत्रित सेल आसंजन-आधारित सिग्नलिंगमध्ये कार्य करते.
सेल्युलर स्तरावर SPECC1L ची भूमिका वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी, आम्ही SPECC1L18 मध्ये पूर्वी वर्णन केलेली स्थिर ऑस्टियोसारकोमा सेल लाइन U2OS ची कमतरता वापरली.SPECC1L (kd) नॉकडाउनसह या स्थिर U2OS पेशींमध्ये SPECC1L प्रतिलेख आणि प्रथिनांच्या पातळीत एक मध्यम (60-70%) घट झाली होती, तसेच ऍक्टिन सायटोस्केलेटन 18 च्या स्थलांतर आणि पुनर्रचनामधील दोषांसह, याउलट, तीव्र क्षणिक घट SPECC1L मुळे माइटोटिक दोष दिसून आले आहेत 23.पुढील व्यक्तिचित्रण केल्यावर, आम्हाला आढळले की आमच्या स्थिर SPECC1L-kd पेशींनी अतिशय उच्च प्रमाणात संगमावर मॉर्फोलॉजी बदलली आहे (आकृती 1).कमी संगमावर वैयक्तिक नियंत्रण पेशी आणि kd पेशी सारख्याच दिसल्या (आकृती 1A,D).संलयनानंतर 24 तासांनंतर, नियंत्रण पेशींनी त्यांचा घनदाट आकार (Fig. 1B, E), तर SPECC1L-kd पेशी वाढवल्या (Fig. 1C, F).सेलच्या आकारातील या बदलाची व्याप्ती नियंत्रण पेशी आणि kd पेशी (चित्रपट 1) च्या vivo लाइव्ह इमेजिंगद्वारे कॅप्चर केली गेली.संमिश्र पेशींमध्ये SPECC1L ची भूमिका निश्चित करण्यासाठी, आम्ही प्रथम त्याची अभिव्यक्ती तपासली.आम्हाला आढळले की फ्यूजन (आकृती 1G) वर SPECC1L प्रथिने पातळी वाढली, तर SPECC1L प्रतिलेख पातळी वाढली नाही (आकृती 1H).याव्यतिरिक्त, पेशींची घनता वाढल्यामुळे, SPECC1L प्रथिने इंटरसेल्युलर सीमांवर (Fig. 2A-E) जमा होतात, ज्याचा नमुना पडदा-संबंधित β-catenin (Fig. 2A'-E') सह आच्छादित होतो.SPECC1L चा actin cytoskeleton 18,23 सह संबंध लक्षात घेऊन आम्ही असे गृहित धरले की SPECC1L ऍक्टिन-आधारित अॅडेसिव्ह जंक्शन (AJ) शी संवाद साधतो.
(AF) SPECC1L नॉकडाउन (DF) पेशी नियंत्रण U2OS पेशी (AC) च्या तुलनेत उच्च संगमावर (F) वाढतात.आम्ही वेगवेगळ्या सेल घनतेसाठी निवडलेले सहा टाइम पॉइंट्स (T1, T3, T6) पैकी तीन येथे दाखवले आहेत.(G) वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण हे दर्शविते की SPECC1L प्रथिने नियंत्रण पेशींमध्ये कमी प्रमाणात संगमाच्या तुलनेत उच्च प्रमाणात संगमावर स्थिर होते.SPECC1L चा वेस्टर्न ब्लॉट अपेक्षित 120 kDa बँड आणि उच्च आण्विक वजनाचा बँड दर्शवितो, शक्यतो भाषांतरानंतर सुधारित (*).कमी आणि उच्च संगमासाठी समान परिस्थितीत वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण केले गेले.कमी आणि उच्च संगमावर SPECC1L दर्शविणार्‍या प्रतिमा त्याच ब्लॉटमधून घेतल्या गेल्या आहेत.तोच डाग काढून टाकण्यात आला आणि β-actin अँटीबॉडीने पुन्हा तपासण्यात आला.(H) परिमाणात्मक RT-PCR विश्लेषणाने SPECC1L उतार्‍याच्या पातळीत कोणतेही लक्षणीय बदल दाखवले नाहीत.एरर बार चार स्वतंत्र प्रयोगांमधून SEM चे प्रतिनिधित्व करतात.
(AE) SPECC1L नॉकडाउन (kd) सह सेल आकार विश्लेषण आणि U2OS सेलमधील AJ बदल सामान्य करण्यासाठी सेल घनतेच्या श्रेणीचे प्रतिनिधित्व करणारे सहा टाइम पॉइंट्स (T1-T6) निवडले.यातील पहिल्या पाच टाइम पॉइंट्समध्ये सिंगल सेल्स (T1), स्मॉल सेल क्लस्टर्सचे 50-70% फ्यूजन (T2), केडी सेल (T3) रीशेप न करता फ्यूजन, केडी सेल (T4) रीशेपिंग आणि 24 तास बदल समाविष्ट होते.kd (T5) पेशींच्या मागील स्वरूपात.SPECC1L प्रथिने प्रामुख्याने T1 (A) येथे सायटोप्लाझममध्ये विखुरले गेले होते, परंतु त्यानंतरच्या वेळेच्या बिंदूंवर (B-E, बाण) इंटरसेल्युलर सीमांवर त्याचे संचय दिसून आले.(FJ) β-catenin AJ कॉम्प्लेक्सशी संबंधित इंटरसेल्युलर सीमांवर समान संचय दर्शविते.(A'-E') SPECC1L आणि β-catenin उच्च सेल घनतेवर (बाण) सेल बॉर्डरवर ओव्हरलॅपिंग डाग दाखवतात.(F'-J') SPECC1L-kd पेशींमध्ये, β-catenin स्टेनिग कमी सेल घनतेवर (F'-H') सामान्य दिसते, परंतु सेल आकार बदलते (I', J'; बाण), हे दर्शविते की AJ बदलला आहे.बार = 10 µm.
त्यानंतर आम्ही AJ वर SPECC1L च्या कमतरतेचा परिणाम ठरवण्याचा प्रयत्न केला.F-actin, myosin IIb, β-catenin आणि E-cadherin24,25,26,27 या कॅनोनिकल घटकांसह आम्ही अनेक AJ-संबंधित मार्कर वापरले.पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे SPECC1L-kd पेशींमध्ये ऍक्टिन तणाव तंतू वाढले आहेत (चित्र 3A,B) 18.ऍक्टिन फिलामेंट्सशी संबंधित मायोसिन IIb ने विट्रो (Fig. 3C,D) मध्ये SPECC1L-kd पेशींमध्ये समान वाढ दर्शविली.AJ-संबंधित β-catenin सेल झिल्लीवर कॅडेरीनशी बांधले जाते, नियंत्रण क्यूबोसाइट्समध्ये सामान्य "हनीकॉम्ब" अभिव्यक्ती नमुना दर्शविते (चित्र 3E,G).विशेष म्हणजे, कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपी वापरून सपाट प्रतिमांमध्ये, β-catenin (Fig. 3E,F) आणि E-cadherin (Fig. 3G,H) SPECC1L-ची कमतरता असलेल्या पेशींच्या पेशींच्या पडद्यावरील डागांनी विस्तारित डागांचे प्रमुख नमुने दाखवले.केडी पेशींमध्ये AJ-संबंधित β-catenin स्टेनिंगचा हा विस्तार संगमावर सर्वात जास्त स्पष्ट होता, परंतु सेल आकारात बदल होण्यापूर्वी दिसून आला (Fig. 2F-J, F'-J').या विस्तारित AJ स्टेनिंगचे भौतिक स्वरूप निश्चित करण्यासाठी, आम्ही ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी (TEM) (आकृती 3I,J) द्वारे SPECC1L-kd U2OS पेशींच्या एपिकल-बेसल पृष्ठभागावरील सेल सीमा तपासल्या.कंट्रोल सेल्स (Fig. 3I) च्या उलट, ज्यात AJ (बाण) दर्शवणारे वेगळे इलेक्ट्रॉन घनता क्षेत्र होते, kd पेशी (Fig. 3J) ने एपिकोबासल समतल बाजूने AJ च्या उच्च इलेक्ट्रॉन घनतेचे सूचक मोठे, संलग्न प्रदेश दाखवले..याव्यतिरिक्त, आडवा भागांवर, आम्ही kd पेशींमध्ये (Fig. S1A,B) विस्तृत सेल मेम्ब्रेन फोल्ड्सचे निरीक्षण केले, जे β-catenin आणि E-cadherin स्टेनिंग बँड (Fig. 3F,H) च्या विस्तारित पॅटर्नचे स्पष्टीकरण देते.AJs मधील SPECC1L च्या भूमिकेच्या समर्थनार्थ, β-catenin ला SPECC1L सह सह-इम्युनोप्रीसिपिटेटेड U2OS पेशींच्या लायसेट्समध्ये (चित्र 3K).AJ मार्करसाठी विस्तारित इम्युनोस्टेनिंगसह, TEM विश्लेषण आमच्या गृहितकाशी सुसंगत होते की SPECC1L ची कमतरता AJ एपिकल-बेसल घनता आणि भिन्नता वाढवते.
(एएच) केडी पेशींमध्ये 48 तासांनंतर-फ्यूजन (टी 6; ए, बी) मध्ये एफ-अॅक्टिनचे डाग वाढले.F-actin (C, D) शी संबंधित मायोसिन IIb चे बदललेले डाग.SPECC1L-kd (F, H) पेशींमध्ये नियंत्रण पेशी (E, G) मध्ये β-catenin आणि E-cadherin मेम्ब्रेन स्टेनिंगचा गुळगुळीत नमुना वाढविला गेला.बार = 10 µm.(I-J) एपिकल-बेसल इंटरसेल्युलर जंक्शनचे निरीक्षण करणारे इलेक्ट्रॉन मायक्रोग्राफ.नियंत्रण पेशी चिकट जंक्शन (I, बाण) दर्शविणारे वेगळे इलेक्ट्रॉन-दाट प्रदेश दाखवतात.याउलट, SPECC1L-kd पेशींमधील संपूर्ण एपिकल-बेसल जंक्शन इलेक्ट्रॉन दाट (J, बाण) दिसले, जे चिकट जंक्शन्सची वाढलेली घनता आणि फैलाव दर्शवते.(K) β-catenin ला SPECC1L सह सह-इम्युनोप्रीसिपिटेटेड U2OS सेल लाइसेट्समध्ये सह-प्रतिरक्षित केले गेले.चार स्वतंत्र प्रयोगांपैकी एकाचे प्रतिनिधित्व करणारी एका ठिकाणाहून घेतलेली प्रतिमा.
क्रॅनिओफेशियल मॉर्फोजेनेसिसमध्ये SPECC1L ची भूमिका समजून घेण्यासाठी, आम्ही दोन स्वतंत्र ES ट्रॅप सेल लाइन्स, DTM096 आणि RRH048 (BayGenomics, CA) वापरून एक Specc1l कमतरता असलेले माउस मॉडेल तयार केले, जे इंट्रॉन 1 आणि Specc1l प्रतिलेखांचे प्रतिनिधित्व करतात (F15) येथे कॅप्चर केले गेले. .4A, आकृती S2).डीकोय व्हेक्टर इन्सर्टचे जीनोमिक स्थान संपूर्ण जीनोम अनुक्रमाद्वारे निर्धारित केले गेले आणि पीसीआर (चित्र S2) द्वारे पुष्टी केली गेली.दोन्ही जीन ट्रॅप डिझाईन्सने कॅप्चर केल्यावर Specc11-lacZ रिपोर्टर्सच्या इन-फ्रेम फ्यूजनला देखील अनुमती दिली.म्हणून, X-gal staining द्वारे निर्धारित lacZ अभिव्यक्ती Specc11 अभिव्यक्तीचे सूचक म्हणून वापरली गेली.इंट्रोन 1 मधील डीटीएम096 जनुक सापळ्यासह, इंट्रोन 15 मधील आरआरएच048 पेक्षा अधिक मजबूत अभिव्यक्ती दर्शविणारी (दर्शविलेली नाही).तथापि, E8.5 (आकृती 4B), न्यूरल ट्यूब आणि E9.5 आणि E10.5 (आकृती 4C,D) येथे चेहर्यावरील प्रक्रिया आणि विकसित अंगांमध्ये, विशेषत: मजबूत अभिव्यक्तीसह, स्पेक1l व्यापकपणे व्यक्त केले जाते. E10 वर.5 आणि डोळे (आकृती 4D).आम्ही पूर्वी नोंदवले आहे की E10.5 येथील पहिल्या घशाच्या कमानातील SPECC1L अभिव्यक्ती एपिथेलियम आणि अंतर्निहित मेसेन्काइम 18 मध्ये उपस्थित होती, सीएनसीसी वंशाशी सुसंगत.CNCC मध्ये SPECC1L अभिव्यक्ती तपासण्यासाठी, आम्ही E8.5 न्यूरल फोल्ड (आकृती 4E-J) आणि E9.5 कवटीचे विभाग (आकृती 4K-) केले.E8.5 वर, SPECC1L ने एनसीसी मार्कर (Fig. 4G, J) सह डागलेल्या पेशींसह (Fig. 4E, H) न्यूरल फोल्ड्स तीव्रतेने डागले.E9.5 वर, SPECC1L (Fig. 4K, N) AP2A (Fig. 4L, M) किंवा SOX10 (Fig. 4O, P) सह सह-स्टेन्ड केलेले स्थलांतरित CNCC जोरदार स्टेन्ड.
(A) ES DTM096 (इंट्रॉन 1) आणि RRH048 (इंट्रॉन 15) सेल क्लोनमध्ये डिकॉय व्हेक्टर इन्सर्टेशन दर्शवणारे माऊस Specc11 जनुकाचे योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व.(BD) E8.5 ते E10.5 पर्यंत Specc1l अभिव्यक्ती दर्शविणाऱ्या विषमजीवी Specc1lDTM096 भ्रूणांचे lacZ डाग.NE = neuroectoderm, NF = न्यूरल फोल्ड, PA1 = प्रथम घशाची कमान.(EP) E8.5 (NF; EJ) न्यूरल फोल्ड्स आणि E9.5 (KP) कवटीच्या विभागात NCC मार्कर AP2A आणि SOX10 सह SPECC1L इम्युनोस्टेनिंग.AP2A (F, G; अॅरोहेड्स) आणि SOX10 (I, J; बाणाचे डोके) लेबल केलेल्या पेशींसह, न्यूरल फोल्ड्स E8.5 (E, H; बाणांच्या चौकटीत) SPECC1L डाग मोठ्या प्रमाणावर दिसून आले.E9.5 वर, SPECC1L ने AP2A (L, M; बाण) आणि SOX10 (O, P; बाण) लेबल केलेले स्थलांतरित CNCCs (K, N; बाण) जोरदार स्टेन्ड केलेले आहेत.
विषमयुग्ध Specc1lDTM096/+ आणि Specc1lRRH048/+ उंदरांमध्‍ये ओलांडल्‍याने असे दिसून येते की दोन जनुक सापळ्यातील अ‍ॅलेल्स पूरक नाहीत आणि एकतर जीन ट्रॅप ऍलीलसाठी संयुग हेटरोझायगोट्स आणि भ्रूण होमोझिगोट्स भ्रूण घातक आहेत (टेबल S1).मेंडेलियन गुणोत्तराने जन्माच्या वेळी हेटरोजायगोट्सच्या जगण्याच्या दरात घट दर्शविली (अपेक्षित 1.34 वि. 2.0).आम्‍ही हेटरोजायगोट्समध्‍ये कमी प्रसूतिपूर्व मृत्‍युदराची नोंद केली, काहींना क्रॅनिओफेशियल विसंगती होती (चित्र S3).तथापि, या पेरिनेटल क्रॅनिओफेसियल फिनोटाइपच्या कमी प्रवेशामुळे त्यांच्या अंतर्निहित पॅथोफिजियोलॉजिकल यंत्रणेचा अभ्यास करणे कठीण होते.म्हणून, आम्ही homozygous Specc11 उत्परिवर्तींच्या भ्रूण घातक फेनोटाइपवर लक्ष केंद्रित केले.
E9.5–10.5 (Figs. 5A–D) नंतर बहुतेक संयुग हेटरोझिगस किंवा homozygous Specc1lDTM096/RRH048 उत्परिवर्ती भ्रूण विकसित झाले नाहीत, आणि न्यूरल नलिका आधीपासून बंद झाली नाही (Figs. 5B, D) आणि काहीवेळा मागे बंद झाली (दर्शविले नाही) ..हा क्रॅनियल न्यूरल ट्यूब क्लोजर दोष E10.5 वर न्यूरल फोल्ड्समध्ये शिल्लक असलेल्या CNCC चिन्हांकित DLX2 च्या बहुसंख्य भागांशी संबंधित होता, जो विच्छेदन नाही (आकृती 5A'-D') दर्शवितो.CNCC चा एकूण आकार देखील कमी केला गेला आहे की नाही हे निर्धारित करण्यासाठी, आम्ही Wnt1-Cre आणि ROSAmTmG सह आमच्या जीन ट्रॅप लाईन्समध्ये GFP सह CNCC रेषा टॅग केल्या.आम्ही संपूर्ण भ्रूणांमधून क्रमवारी लावलेले GFP+ NCC आणि GFP- (RFP+) नॉन-एनसीसी प्रवाहित करतो.E9.5 वर, प्रवाह-क्रमांकित GFP-लेबल केलेल्या CNCC चे प्रमाण WT आणि उत्परिवर्ती भ्रूण (दाखवलेले नाही), सामान्य CNCC तपशील दर्शविते दरम्यान लक्षणीय बदलले नाही.त्यामुळे, आम्ही असे गृहित धरले की उघड झालेल्या न्यूरल फोल्ड्समध्ये (आकृती 5B') अवशिष्ट Wnt1-Cre आणि DLX2 डाग दोषपूर्ण CNCC लेयरिंगमुळे होते, शक्यतो SPECC1L-kd पेशींमध्ये पाहिल्याप्रमाणे, AJ पेशींच्या वाढीव घनतेमुळे किंवा फैलावमुळे.न्यूरल फोल्ड (आकृती 5E-R) मध्ये CNCC च्या उपस्थितीची पुष्टी करण्यासाठी आम्ही NCC मार्कर SOX10, AP2A आणि DLX2 वापरले.E8.5 वर, WT (Fig. 5E, G, I) आणि Specc1l उत्परिवर्ती (Fig. 5F, H, J) विभागांमध्ये तीनही NCC मार्करसाठी न्यूरल फोल्ड स्टेनिंग दिसून आले.E9.5 वर, NCC मार्करने WT विभागांमध्ये (Fig. 5M, O, Q) स्थलांतरित NCC डाग केलेले असताना, Specc1l उत्परिवर्ती भ्रूणांच्या (Fig. 5N, P, R) उघडलेल्या न्यूरल फोल्डमध्ये अवशिष्ट NCC डाग दिसून आले.कारण SOX10 आणि DLX2 चिन्हांकित CNCCs स्थलांतरित करतात, हा परिणाम सूचित करतो की SPECC1L-कमतर CNCCs पोस्ट-माइग्रेटरी स्पेसिफिकेशन प्राप्त करतात परंतु न्यूरल फोल्ड्समधून स्थलांतर करण्यात अयशस्वी होतात.
Specc11 च्या कमतरतेमुळे न्यूरल ट्यूब दोषपूर्ण बंद होते, क्रॅनियल न्यूरल क्रेस्ट पेशी आणि AJs चे विघटन होते.
(A, B') E9.5 WT (A) स्थलांतरित क्रॅनियल न्यूरल क्रेस्ट पेशी (CNCC) वाहून नेणारा गर्भ Wnt1-Cre (A') ने लेबल केलेला आहे.याउलट, Specc11 उत्परिवर्ती भ्रूण ओपन न्यूरल फोल्ड (B), बाणाचे डोके) आणि स्थलांतरित न झालेले CNCC (B', बाणाचे डोके) दर्शवतात.(C, D') E10.5 WT भ्रूण (C, C') आणि Specc1l (D, D') च्या CNCC मार्कर DLX2 चे तेजस्वी फील्ड प्रतिमा (C, D') आणि इम्युनोस्टेनिंग (C', D').WT E10.5 भ्रूणांमध्ये, DLX2-पॉझिटिव्ह CNCC गिल कमानी (C', बाण) मध्ये वसाहत करतात, तर उत्परिवर्तींमध्ये, उघड्या न्यूरल फोल्ड्स (D', बाण) आणि पहिल्या घशाच्या कमानीमध्ये (D',) स्पष्ट डाग कायम राहतात. बाण).) काही डाग (बाण) सह सीएनसीसीचे खराब डिलेमिनेशन आणि स्थलांतर दर्शवते.ER) E8.5 (E–L) आणि E9.5 (M–R) टप्प्यांवर WT आणि Specc1l उत्परिवर्ती भ्रूणांचे विभाग एनसीसी मार्कर SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H,) सह लेबल केलेले होते. O, P ) आणि DLX2 (I, J, Q, R).E8.5 वर, वाइल्ड-टाइप न्यूरल फोल्ड (NF) आणि उत्परिवर्ती विभागात NCC डाग दिसून आला.E8.5 WT (K) आणि उत्परिवर्ती (L) मधील SOX10 आणि β-catenin च्या सह-स्टेनिंगमुळे न्यूरल फोल्ड्समधील पेशींच्या सीमांवर β-catenin स्टेनिग वाढल्याचे दिसून आले.E9.5 वर, स्थलांतरित CNCCs (M, O, Q) चे जंगली-प्रकारचे डाग दिसून आले, तर उत्परिवर्तींमध्ये, unstratified CNCCs स्टेन्ड ओपन न्यूरल फोल्ड्स (N, P, R).(S–Z) डब्ल्यूटीच्या कोरोनल विभागांमध्ये विवो एजे लेबलिंग विश्लेषण आणि E9.5 उत्परिवर्तनासह Specc11DTM096/RRH048 भ्रूण.वरच्या उजव्या कोपर्यात अंदाजे विभागीय विमान दर्शविले आहे.उत्परिवर्ती ऊतकांच्या विभागात, एफ-अॅक्टिन (एस, टी) आणि मायोसिन IIb (यू, व्ही) चे वाढलेले डाग दिसून आले.अंजीर 3 मधील इन विट्रो परिणामांप्रमाणेच, उत्परिवर्ती भ्रूणांमध्ये, β-catenin (W, X) आणि E-cadherin (Y, Z) साठी वर्धित पडदा डाग दिसून आला.(AA-BB) एपिकल-बेसल सेलच्या सीमेच्या पलीकडे दिसणार्‍या जंगली-प्रकारच्या गर्भाच्या एका विभागाचा इलेक्ट्रॉन मायक्रोग्राफ चिकट जंक्शन्स (AA, बाण) दर्शविणारा एक वेगळा इलेक्ट्रॉन-दाट प्रदेश दर्शवितो.याउलट, Specc11 उत्परिवर्ती भ्रूण (BB, बाण) च्या विभागांमध्ये, संपूर्ण एपिकोबासल जंक्शन इलेक्ट्रॉन घनता आहे, जे चिकट जंक्शन्सची वाढलेली घनता आणि फैलाव दर्शवते.
बदललेल्या AJ मुळे लेयरिंग कमी झाले आहे या आमच्या गृहीतकाची चाचणी घेण्यासाठी, आम्ही Specc1l उत्परिवर्ती भ्रूणांच्या (Fig. 5S-Z) उघडलेल्या न्यूरल फोल्डमध्ये AJ लेबलिंगची तपासणी केली.आम्ही ऍक्टिन तणाव तंतूंमध्ये वाढ (Fig. 5S, T) आणि ऍक्टिन तंतूंवर (Fig. 5U, V) मायोसिन IIB स्टेनिंगचे स्थानिकीकरण वाढलेले आढळले.महत्त्वाचे म्हणजे, आम्ही इंटरसेल्युलर सीमांवर β-केटिनिन (Fig. 5W,X) आणि E-cadherin (Fig. 5Y,Z) चे वाढलेले डाग पाहिले.आम्ही E8.5 भ्रूण (Fig. 5K, L) च्या न्यूरल फोल्ड्समध्ये NCC चे β-catenin स्टेनिंग देखील तपासले.Specc1l म्युटंट न्यूरल फोल्ड्स (Fig. 5L आणि K) मध्ये β-catenin स्टेनिंग अधिक मजबूत असल्याचे दिसून आले, जे सूचित करते की AJ बदल सुरू झाले आहेत.E9.5 भ्रूणांच्या कवटीच्या भागांच्या इलेक्ट्रॉन मायक्रोग्राफमध्ये, आम्ही पुन्हा WT (Fig. 5AA, BB आणि S1E-H) च्या तुलनेत Specc1l उत्परिवर्ती भ्रूणांमध्ये वाढलेले डिफ्यूज इलेक्ट्रॉन-दाट डाग पाहिले.एकत्र घेतल्यास, हे परिणाम SPECC1L-kd U2OS पेशींमध्ये आमच्या इन विट्रो परिणामांना समर्थन देतात आणि असे सुचवतात की आमच्या उत्परिवर्ती भ्रूणांमध्ये CNCC स्तरीकरणापूर्वी एबरंट एजे स्टेनिंग आहे.
AKT क्रियाकलाप आणि E-cadherin स्थिरता यांच्यातील ज्ञात विरोधी संबंध लक्षात घेता, 17,28 आम्ही PI3K-AKT सिग्नलिंगच्या सहभागाची कल्पना केली.या व्यतिरिक्त, आम्ही आमच्या काही उत्परिवर्ती भ्रूणांमध्ये सबएपिडर्मल ब्लिस्टरिंगचे निरीक्षण केले जे E9.5-10.5 येथे प्राणघातकतेपासून (<5%) सुटले आणि त्याऐवजी E13.5 (Fig. S3) वर स्थिर झाले.सबपीडर्मल वेसिकल्स हे PDGFRα12 वर आधारित कमी झालेल्या PI3K-AKT सिग्नलिंगचे वैशिष्ट्य आहे.Fantauzzo et al.(2014) नोंदवले आहे की PdgfraPI3K/PI3K उत्परिवर्ती भ्रूणांमध्ये PDGFRα-आधारित PI3K सक्रियकरणात व्यत्यय आल्याने उपपिडर्मल वेसिकल्स, न्यूरल ट्यूब दोष आणि क्लीफ्ट पॅलेट फिनोटाइप होतात.खरंच, पॅन-AKT आणि सक्रिय फॉस्फोरिलेटेड Ser473-AKT चे स्तर Specc1l उत्परिवर्ती ऊतकांमध्ये विवोमध्ये E9.5 भ्रूण अटक (चित्र 6A-D) पर्यंत कमी केले गेले.फॉस्फोरिलेटेड Ser473-AKT च्या पातळीतील घट पूर्णपणे विवो (FIG. 6E) आणि इन विट्रो (FIG. 6F) मधील पॅन-AKT च्या पातळीत घट झाल्यामुळे असू शकते.जेव्हा U2OS पेशी सेल आकार आणि AJ घनता (आकृती 6D) मधील बदलांशी जोरदारपणे एकत्र होते तेव्हाच विट्रोमध्ये घट दिसून आली.अशाप्रकारे, आमचा डेटा सूचित करतो की SPECC1L क्रॅनिओफेशियल मॉर्फोजेनेसिसमध्ये PI3K-AKT सिग्नलिंगचे एक नवीन सकारात्मक नियामक आहे.
(A–E) E8.5 (A,B) आणि E9.5 (C,D) कवटीचे विभाग किंवा Specc1l उत्परिवर्ती भ्रूण (E) पासून E9.5 lysates सक्रिय फॉस्फोरिलेटेड S473-AKT आणि पॅन-AKT प्रथिने घट दर्शविते , नियंत्रण WT च्या तुलनेत.पाश्चात्य ब्लॉटिंग जंगली-प्रकारच्या लाइसेट्स आणि उत्परिवर्ती लाइसेट्सवर समान परिस्थितीत केले गेले.SPECC1L साठी दर्शविलेल्या प्रतिमा एका डागातून घेतल्या गेल्या आहेत.तोच डाग काढून टाकण्यात आला आणि अँटी-पॅन-एसीटी आणि β-अॅक्टिन अँटीबॉडीजसह पुन्हा तपासण्यात आला.E8.5 न्यूरल फोल्ड्स (A, B) मधील पॅन-AKT पातळी आणि E9.5 कवटीच्या विभागात फॉस्फोरिलेटेड S473-AKT चे स्तर लक्षणीयरीत्या कमी झाले.(F) उच्च संगमावर कापणी केलेल्या SPECC1L-kd U2OS पेशींच्या लाइसेट्समध्ये पॅन-AKT पातळी त्याचप्रमाणे कमी केली गेली.एरर बार तीन स्वतंत्र वेस्टर्न ब्लॉट क्वांटिफिकेशन्समधील SEM चे प्रतिनिधित्व करतात.(GJ) E9.5 वरील WT भ्रूणांचे विभाग अनुक्रमे KI67 आणि क्लीव्हड कॅस्पेस 3 सह डागलेले आहेत, सेल प्रसार (G, G') आणि थोडे अपोप्टोटिक क्रियाकलाप (H, H') दर्शवित आहेत.Specc11 उत्परिवर्ती भ्रूण तुलनात्मक पेशी प्रसार (I) दर्शविते, परंतु अपोप्टोसिसमधून जात असलेल्या पेशींची संख्या लक्षणीय वाढली आहे (J).
त्यानंतर आम्ही प्रसार आणि ऍपोप्टोसिसच्या मार्करची तपासणी केली.WT म्युटंट्ससाठी 82.5% आणि KI67 स्टेनिंग (p <0.56, फिशर्स) द्वारे मोजल्या गेलेल्या Specc1l म्युटंटसाठी 82.5% च्या प्रसार निर्देशांकासह E9.5 भ्रूणांच्या (I च्या तुलनेत Fig. 6E, G) प्रसारामध्ये आम्हाला कोणताही फरक आढळला नाही. अचूक चाचणी).त्याचप्रमाणे, आम्ही E8.5 वर न्यूरल फोल्ड्समध्ये क्लीव्हड कॅस्पेस 3 साठी स्टेनिंगद्वारे मोजलेल्या ऍपोप्टोसिसमध्ये कोणताही फरक भ्रूण अटक होईपर्यंत (दर्शविलेला नाही) (दर्शविलेला नाही) पाहिला नाही.याउलट, सर्व E9.5 उत्परिवर्ती भ्रूणांमध्ये (Fig. 6F, H आणि J) ऍपोप्टोसिस लक्षणीयरीत्या वाढले होते.ऍपोप्टोसिसमध्ये ही एकूण वाढ कमी झालेली PI3K-AKT सिग्नलिंग आणि लवकर भ्रूण घातकता 29,30,31 सह सुसंगत आहे.
पुढे, आमच्या kd पेशींमधील AJ बदलांमध्ये PI3K-AKT सिग्नलिंगसाठी कारणीभूत भूमिकेची पुष्टी करण्यासाठी, आम्ही नियंत्रण आणि kd पेशी (आकृती 7A-F) मधील मार्ग रासायनिकरित्या बदलला.आम्ही संगम SPECC1L-kd पेशींमध्ये आढळून आलेला सेल आकार बदलाचा फेनोटाइप मार्कर म्हणून वापरला, ज्याची आम्ही संबंधित उभ्या परिमाणे (रुंदी) सर्वात लांब परिमाण (लांबी) च्या गुणोत्तराचा वापर करून परिमाण केले.तुलनेने गोल किंवा घनदाट पेशींसाठी 1 चे प्रमाण अपेक्षित आहे (आकृती 7G).सेल आकाराव्यतिरिक्त, आम्ही β-केटिनिन स्टेनिंग (Fig. 7A'-F') द्वारे AJ वर प्रभाव देखील पुष्टी केली.वॉर्टमॅनिन वापरून PI3K-AKT मार्गाचा प्रतिबंध नियंत्रण पेशी (आकृती 7A,C) आणि AJ (आकृती 7A') मध्ये सेल आकार बदलण्यासाठी पुरेसा होता.PI3K-AKT अॅक्टिव्हेटर SC-79 ने नियंत्रण पेशींमध्ये सेल आकार (FIG. 7A, E) किंवा AJ विस्तार (FIG. 7A') प्रभावित केला नाही.SPECC1L-kd पेशींमध्ये, PI3K-AKT मार्गाच्या पुढील दडपशाहीमुळे ऍपोप्टोसिस (Fig. 7B,D) वाढले आणि β-catenin स्टेनिग (Fig. 7B') मध्ये लक्षणीय वाढ झाली, आमच्या इन व्हिव्हो हेवी म्युटंट्सशी सुसंगत.महत्त्वाचे म्हणजे, PI3K-AKT मार्ग सक्रिय केल्याने सेल आकार (आकृती 7B,F) आणि AJ phenotypes (आकृती 7B") मध्ये लक्षणीय सुधारणा झाली.सेलच्या आकारातील बदलांना सेल गोलाकारपणा प्रमाण (सीसीआर) म्हणून परिमाणित केले गेले आणि वर वर्णन केल्याप्रमाणे महत्त्वाची तुलना केली गेली (FIG. 7G).खरंच, नियंत्रण पेशींमध्ये (Fig. 7G, CCR = 1.56), वॉर्टमॅनिन उपचार सेल आकारात लक्षणीय बदल करण्यासाठी पुरेसा होता (Fig. 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9). SPECC1L मध्ये.-kd पेशी (Fig. 7G, CCR = 3.46).SPECC1L-kd पेशींवर वॉर्टमॅनिन उपचार (Fig. 7G, CCR = 3.60, नगण्य) उपचार न केलेल्या kd पेशी (Fig. 7G, CCR = 3.46, नगण्य) किंवा wortmannin-उपचारित नियंत्रण पेशी (Fig. 7G) पेक्षा जास्त लक्षणीय नव्हते., CCR = 3.46, नगण्य) अतिरिक्तपणे सेल लांबणीवर परिणाम करते (7G, CCR = 3.61, नगण्य).सर्वात महत्त्वाचे म्हणजे, SC-79 AKT अॅक्टिव्हेटरने SPECC1L-kd पेशींचे लांबलचक फिनोटाइप पुनर्संचयित केले (चित्र 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).हे परिणाम पुष्टी करतात की SPECC1L PI3K-AKT सिग्नलिंगचे नियमन करते आणि सुचविते की SPECC1L मधील मध्यम घट पेशींच्या आसंजनावर परिणाम करते, तर मजबूत घट ऍपोप्टोसिस (चित्र 8) ठरते.
(A–F') नियंत्रण (A, C, E) आणि SPECC1L-kd (B, D, F) पेशींवर PI3K-AKT पाथवे इनहिबिटर वोर्टमनिन (C, D) किंवा SC-79 एक्टिवेटर (E, F) उपचार .उपचार न केलेले नियंत्रण पेशी सामान्य β-मांजर सेल्युलर स्टेनिंग (A') सह घनदाट (A) असतात, तर kd पेशी वाढलेल्या β-cat staining (B') सह लांबलचक (B) असतात.PI3K-AKT मार्गाच्या दडपशाहीनंतर, नियंत्रण पेशी β-cat विस्तार (C') सह लांबलचक (C) झाल्या, तर kd पेशी आपल्या अत्यंत उत्परिवर्तित भ्रूणांप्रमाणेच ऍपोप्टोसिस (D) होऊ लागल्या आणि अत्यंत वर्धित β-cat दर्शवितात.डाग (डी').PI3K-AKT मार्ग सक्रिय केल्यानंतर, नियंत्रण पेशी घनदाट (E) राहिल्या आणि सामान्य β-cat (E') डाग होते, तर kd पेशींमध्ये लक्षणीय सुधारित सेल आकार (F) आणि β-cat (F') डाग दिसून आला, जे सूचित करते (G) (AF) मध्ये सेल आकार बदलाची डिग्री मेटामॉर्फ सॉफ्टवेअर वापरून सर्वात लांब परिमाण (लांबी) चे सेल गोलाकार गुणोत्तर (CCR) आणि संबंधित अनुलंब परिमाण (रुंदी) वापरून परिमाणित केले गेले.उपचार न केलेले (NT) SPECC1L-kd पेशी (CCR = 3.46) नियंत्रण पेशी (CCR = 1.56, p < 6.1 × 10–13) पेक्षा लक्षणीयरीत्या लांब होत्या.नियंत्रण पेशींमध्ये PI3K-AKT मार्गाचा वॉर्टचा प्रतिबंध सेल आकारात समान वाढ होण्यासाठी पुरेसा होता (CCR=3.61, p<2.4×10-9).त्याचप्रमाणे, SPECC1L-kd पेशींमध्ये SC-79 द्वारे AKT सक्रिय केल्याने नियंत्रण पातळी (CCR = 1.74, p < 6.2 × 10-12) पर्यंत पेशी वाढवणे पुनर्संचयित केले.SPECC1L-kd पेशींवर वॉर्टमॅनिन उपचार केल्याने ऍपोप्टोसिस वाढले परंतु उपचार न केलेल्या kd (CCR=3.46, ns) किंवा वॉर्टमॅनिन-उपचार केलेल्या नियंत्रण पेशी (3.61) च्या तुलनेत पेशींच्या आकारात बदल (CCR=3.60) झाला नाही.ns = काही फरक पडत नाही.+/- 50 सेलसाठी SEM मापन दाखवले आहे.विद्यार्थ्याच्या टी-चाचणीचा वापर करून सांख्यिकीय फरकांची गणना केली गेली.
(A) PI3K-AKT मार्गाच्या प्रतिबंध आणि सक्रियतेचे योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, परिणामी AJ बदल आणि बचाव, अनुक्रमे.(B) SPECC1L द्वारे AKT प्रोटीन स्थिरीकरणासाठी प्रस्तावित मॉडेल.
प्रिमिग्रेटरी CNCCs ला पूर्ववर्ती न्यूरल फोल्ड न्यूरोएपिथेलियल पेशी 1,15,32 पासून वेगळे करण्यासाठी AJ lysis आवश्यक आहे.AJ घटकांचे वाढलेले डाग आणि SPECC1L-विट्रो आणि व्हिव्हो दोन्हीमध्ये apical-basal AJ असममित वितरणाचे नुकसान, SPECC1L ते β-catenin च्या भौतिक समीपतेसह एकत्रितपणे, AJ स्थानिक स्थिरता योग्यरित्या राखण्यासाठी SPECC1L कार्य करते. संघटना स्नायू.ऍक्टिन सायटोस्केलेटन.SPECC1L चा actin cytoskeleton आणि β-catenin सोबतचा संबंध आणि SPECC1L च्या अनुपस्थितीत कंडेस्ड ऍक्टिन फिलामेंट्सच्या संख्येत झालेली वाढ हे AJ घनतेत आढळलेल्या वाढीशी सुसंगत आहे.दुसरी शक्यता अशी आहे की SPECC1L- कमतरतेच्या पेशींमध्ये ऍक्टिन तंतूंच्या वाढीव संख्येमुळे इंटरसेल्युलर तणावात बदल होतो.सेल्युलर तणाव AJ 33 डायनॅमिक्सवर परिणाम करत असल्याने, व्होल्टेज बदलामुळे AJ 34 अधिक पसरू शकते.त्यामुळे कोणतेही बदल CNCC स्तरांवर परिणाम करतात.
Wnt1 सुरुवातीच्या न्यूरल फोल्ड्समध्ये व्यक्त केले जाते जे न्यूरल क्रेस्ट पेशींना जन्म देतात.अशा प्रकारे, Wnt1-cre वंशाचे ट्रेसिंग NCC35-पूर्व आणि स्थलांतरित दोन्ही चिन्हांकित करते.तथापि, Wnt1 सुरुवातीच्या न्यूरल फोल्ड्स 35,36 मधून प्राप्त झालेल्या पृष्ठीय मेंदूच्या ऊतींचे क्लोन देखील चिन्हांकित करते, ज्यामुळे ओपन न्यूरल फोल्ड्समध्ये Wnt1 मार्करसाठी E9.5 उत्परिवर्तींचे डाग CNCC नसण्याची शक्यता निर्माण करते.NCC मार्कर AP2A आणि SOX10 साठी आमच्या सकारात्मक डागांनी पुष्टी केली की Specc11 उत्परिवर्ती भ्रूणांच्या उघड झालेल्या न्यूरल फोल्डमध्ये CNCC होते.याव्यतिरिक्त, AP2A आणि SOX10 हे लवकर स्थलांतरित NCC चे मार्कर असल्याने, सकारात्मक डाग हे सूचित करतात की या पेशी स्थलांतरानंतरच्या CNCC आहेत ज्यांना E9.5 द्वारे स्तरीकृत केले जाऊ शकत नाही.
आमचा डेटा असे सूचित करतो की SPECC1L द्वारे AJ चे आण्विक नियमन PI3K-AKT सिग्नलिंगद्वारे मध्यस्थ केले जाते.SPECC1L ची कमतरता असलेल्या पेशी आणि ऊतींमध्ये AKT सिग्नलिंग कमी होते.Fantauzzo et al द्वारे निष्कर्ष.क्रॅनिओफेशियल मॉर्फोजेनेसिसमध्ये PI3K-AKT सिग्नलिंगसाठी थेट भूमिकेचे समर्थन करा.(2014) ने दर्शविले की PDGFRα-आधारित PI3K-AKT सिग्नलिंगच्या सक्रियतेच्या कमतरतेमुळे क्लीफ्ट पॅलेट फिनोटाइप होतो.आम्ही हे देखील दर्शवितो की PI3K-AKT मार्गाचा प्रतिबंध U2OS पेशींमध्ये AJ आणि सेल आकार बदलण्यासाठी पुरेसा आहे.आमच्या निष्कर्षांशी सुसंगत, Cain et al.37 ने दर्शविले की एंडोथेलियल पेशींमध्ये PI3K α110 सब्यूनिटचे नियमन केल्याने पेरीसेल्युलर β-केटिनिन स्टेनिंगमध्ये समान वाढ होते, ज्याला "कनेक्टिव्हिटी इंडेक्स" मध्ये वाढ म्हणून संबोधले जाते.तथापि, एंडोथेलियल पेशींमध्ये ज्यांचे ऍक्टिन फिलामेंट्स आधीच अत्यंत व्यवस्थित आहेत, PI3K-AKT मार्गाच्या दडपशाहीमुळे सेल आकार सैल होतो.याउलट, SPECC1L-kd U2OS पेशींनी वाढवलेला सेल आकार दर्शविला.हा फरक सेल प्रकार विशिष्ट असू शकतो.PI3K-AKT सिग्नलिंगचे दडपशाही कायमस्वरूपी ऍक्टिन सायटोस्केलेटनवर परिणाम करते, परंतु पेशींच्या आकारावरील परिणाम मध्यवर्ती ऍक्टिन तंतूंच्या घनतेमध्ये आणि संघटनेतील बदलांमुळे होणार्‍या तणावातील बदलांद्वारे निर्धारित केला जातो.U2OS सेलमध्ये, SPECC1L-कमतरता AJ बदल आणि पुनर्प्राप्तीचा मार्कर म्हणून आम्ही फक्त सेल आकार बदल वापरले.शेवटी, आम्ही असे गृहित धरतो की SPECC1L च्या कमतरतेमध्ये AKT मार्गाचा प्रतिबंध AJ स्थिरता वाढवतो आणि CNCC मधील डिलामिनेशन कमी करतो.
विशेष म्हणजे, AKT प्रोटीन स्थिरता किंवा टर्नओव्हरच्या पातळीवर PI3K-AKT सिग्नलिंगचे नियमन सुचवून, SPECC1L च्या अनुपस्थितीत फॉस्फोरिलेटेड 473-AKT पातळी व्यतिरिक्त विट्रो आणि विवोमध्ये पॅन-AKT पातळी कमी करण्यात आली.SPECC1L आणि MID1 जनुक, दोन्ही Opitz/GBBB सिंड्रोमशी संबंधित, प्रथिने एन्कोड करतात जे मायक्रोट्यूब्यूल्स 18,22 स्थिर करतात.SPECC1L आणि MID1 मायक्रोट्यूब्यूल स्थिरीकरणाची मध्यस्थी करणारी यंत्रणा पूर्णपणे समजलेली नाही.SPECC1L च्या बाबतीत, या स्थिरीकरणामध्ये मायक्रोट्यूब्यूल्स 18 च्या उपसंचाचे वर्धित एसिटिलेशन समाविष्ट आहे.हे शक्य आहे की SPECC1L AKT सारख्या इतर प्रथिनांना स्थिर करण्यासाठी समान यंत्रणा वापरते.हे दर्शविले गेले आहे की AKT प्रथिनातील लाइसिन अवशेषांच्या एसिटिलेशनमुळे पडदा स्थानिकीकरण आणि फॉस्फोरिलेशन 38 मध्ये घट होते.याव्यतिरिक्त, AKT वरील समान लाइसिन अवशेषांवर K63 चेनचे सर्वव्यापीीकरण त्याच्या झिल्ली स्थानिकीकरण आणि सक्रियतेसाठी 39,40 आवश्यक आहे.विविध उच्च थ्रूपुट यीस्ट टू-हायब्रीड स्क्रीनमध्ये ओळखल्या जाणार्‍या SPECC1L प्रथिनांशी संवाद साधणार्‍या अनेक घटकांपैकी चार – CCDC841, ECM2942, APC आणि UBE2I43 – प्रथिने उलाढाल किंवा सर्वव्यापी किंवा सुमोयलेशनद्वारे स्थिरतेमध्ये गुंतलेले आहेत.SPECC1L AKT लाइसिन अवशेषांच्या अनुवादानंतरच्या बदलामध्ये गुंतलेले असू शकते, ज्यामुळे AKT स्थिरतेवर परिणाम होतो.तथापि, AKT प्रोटीनचे स्थानिकीकरण आणि स्थिरतेमध्ये SPECC1L ची महत्त्वपूर्ण भूमिका स्पष्ट करणे बाकी आहे.
व्हिव्होमधील SPECC1L अभिव्यक्तीतील गंभीर दोषांमुळे AJ मार्करचे डाग आणि दोषपूर्ण CNCC आच्छादन, तसेच ऍपोप्टोसिस आणि लवकर भ्रूण घातकता वाढली.मागील अहवालांनी दर्शविले आहे की ऍपोप्टोसिसच्या वाढीव पातळीसह माऊस उत्परिवर्ती न्यूरल ट्यूब दोष 44,45,46,47 आणि क्रॅनिओफेशियल दोष 48 शी संबंधित आहेत.असे सुचवण्यात आले आहे की न्यूरल फोल्ड्स किंवा फॅरेंजियल आर्चमध्ये जास्त प्रमाणात पेशींचा मृत्यू झाल्यास योग्य मॉर्फोजेनेटिक हालचाली 48,49,50 साठी आवश्यक पेशींची अपुरी संख्या होऊ शकते.याउलट, माफक प्रमाणात कमी झालेल्या SPECC1L अभिव्यक्तीसह आमच्या SPECC1L ची कमतरता असलेल्या सेल लाइन्समध्ये वाढलेल्या सेल मृत्यूच्या पुराव्याशिवाय केवळ AJ बदल दिसून आले.तथापि, या Kd पेशींमधील PI3K-AKT मार्गाच्या रासायनिक प्रतिबंधामुळे अपोप्टोसिस वाढले.अशा प्रकारे, SPECC1L अभिव्यक्ती किंवा कार्यामध्ये मध्यम घट सेलचे अस्तित्व सुनिश्चित करते.हे निरीक्षणाशी सुसंगत आहे की दुर्मिळ Specc11 उत्परिवर्ती भ्रूण जे st.E9.5—कदाचित जीन कॅप्चर करण्याच्या कार्यक्षमतेत घट झाल्यामुळे—त्यांच्या न्यूरल ट्युब्स बंद करण्यात आणि नंतरच्या काळात क्रॅनिओफेशियल दोषांसह, बंद करण्यास सक्षम आहेत (Fig. S3).याच्याशी सुसंगत हेटरोझिगस स्पेक1एल भ्रूण क्रॅनिओफेशियल विकृतीसह दुर्मिळ घटना आहे-कदाचित जीन कॅप्चर कार्यक्षमतेत वाढ झाल्यामुळे-तसेच झेब्राफिशमध्ये आढळून आले आहे ज्यामध्ये दोन SPECC1L ऑर्थोलॉग्स (specc1lb) पैकी एक भ्रूण उशीरा नुकसानास कारणीभूत ठरते. खालचा जबडा आणि द्विपक्षीय फाट51.अशाप्रकारे, मानवी रूग्णांमध्ये ओळखल्या जाणार्‍या विषम SPECC1L फंक्शन म्युटेशनमुळे क्रॅनिओफेशियल मॉर्फोजेनेसिस दरम्यान SPECC1L फंक्शनमध्ये लहान बिघाड होऊ शकतो, जे त्यांच्या ओरोफेसियल क्लॅफ्ट्सचे स्पष्टीकरण देण्यासाठी पुरेसे आहे.इंटरसेल्युलर संपर्कांचे SPECC1L-आधारित नियमन पॅलाटोजेनेसिस आणि घशाच्या कमानीच्या संलयनात देखील भूमिका बजावू शकते.SPECC1L फंक्शनच्या पुढील अभ्यासामुळे न्यूरोएपिथेलियल सेल मोटीलिटी आणि क्रॅनिओफेशियल मॉर्फोजेनेसिसमध्ये न्यूरल ट्यूब बंद होण्याच्या दरम्यान CNCC मधील तात्पुरत्या इंटरसेल्युलर संपर्कांची भूमिका स्पष्ट करण्यात मदत होईल.
U2OS osteosarcoma नियंत्रण आणि SPECC1L-kd पेशींचे पूर्वी वर्णन केले गेले आहे (सादी एट अल., 2011).SPECC1L विरुद्ध प्रतिपिंडे देखील पूर्वी वैशिष्ट्यीकृत आहेत (सादी एट अल., 2011).अँटी-बीटा-केटेनिन प्रतिपिंडे (ससा; 1:1000; सांताक्रूझ, डॅलस, TX) (माऊस; 1:1000; सेल सिग्नलिंग टेक्नॉलॉजी, डॅनव्हर्स, एमए), मायोसिन IIb (1:1000; सिग्मा-अल्ड्रिच, सेंट लुईस) ). , कॅलिफोर्निया), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; सेल सिग्नलिंग टेक्नॉलॉजी, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; थर्मोफिशर सायंटिफिक, वॉल्थम, MA ) , KI67 (1:1000; सेल सिग्नलिंग टेक्नॉलॉजी, डॅनव्हर्स, एमए), क्लीव्हड कॅस्पेस 3 (1:1000; सेल सिग्नलिंग टेक्नॉलॉजी, डॅनव्हर्स, एमए) आणि β-अॅक्टिन (1:2500; सिग्मा-अल्ड्रिच, सेंट लुईस, MO ) वर्णन केल्याप्रमाणे वापरले होते..ऍक्टिन फिलामेंट्स ऍक्टी-स्टेन रोडामाइन फॅलोइडिन (सायटोस्केलेटन, डेन्व्हर, कोलोरॅडो) सह डागलेले होते.
U2OS नियंत्रण पेशी आणि SPECC1L-kd पेशी 10% भ्रूण बोवाइन सीरम (लाइफ टेक्नॉलॉजीज, कार्ल्सबॅड, CA) सह पूरक उच्च ग्लुकोज DMEM मध्ये संवर्धित होते.AJ बदलांसाठी, 0.1% पोर्सिन जिलेटिन (सिग्मा-अल्ड्रिच, सेंट लुईस, एमओ) सह उपचार केलेल्या काचेवर 2 x 105 पेशी सीड केल्या गेल्या आणि पेशींच्या आकारातील बदलांचे निरीक्षण केले.पेशी वेगवेगळ्या दर्शविलेल्या वेळेच्या बिंदूंवर गोळा केल्या गेल्या: बीजारोपणानंतर 4 तास (t = 1), बीजनानंतर 24 तास (t = 2), सेल आकारात बदल न करता संगम (t = 3), सेल आकारात बदल (t = 4) , सेल आकार बदलल्यानंतर 24 तास (t = 5) आणि 48 तासांनी सेल आकार बदलल्यानंतर (t = 6) (चित्र 1, 2, 3).PI3K-AKT मार्ग सुधारण्यासाठी, PI3K-AKT इनहिबिटर वोर्टमनिन (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) किंवा SC-79 activator (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota Adams) सह सूचित एकाग्रतेवर पेशींचे संवर्धन केले गेले.रसायने असलेले माध्यम दररोज बदलले जात होते.
फ्रेम-बाय-फ्रेम रेकॉर्डिंग लाइव्ह कंट्रोल आणि केडी सेलवर सामान्य संस्कृतीच्या परिस्थितीत केले गेले आणि फेज कॉन्ट्रास्ट प्रतिमा 7 दिवसांसाठी दर 10 मिनिटांनी गोळा केल्या गेल्या.संगणक-नियंत्रित Leica DM IRB इन्व्हर्टेड मायक्रोस्कोप वापरून प्रतिमा प्राप्त केल्या गेल्या ज्यात यांत्रिक स्टेज आणि QImaging Retiga-SRV कॅमेराशी जोडलेले 10 × N-PLAN उद्दिष्ट आहे.इमेजिंग दरम्यान, 5% CO2 सह आर्द्र वातावरणात सेल कल्चर 37°C वर राखले गेले.
रीजनल म्युटंट माउस रिसोर्स सेंटर (UC डेव्हिस, CA) मधील दोन जनुक ट्रॅप ES सेल लाईन्स DTM096 आणि RRH048 चा वापर Specc11 कमतरता असलेल्या माऊस लाईन्स, Specc1lgtDTM096 आणि Specc1lgtRRH046 तयार करण्यासाठी केला गेला.थोडक्यात, 129/REJ ES पेशी C57BL6 ब्लास्टोसिस्टमध्ये इंजेक्ट केल्या गेल्या.परिणामी काइमेरिक नर उंदरांची पैदास मादी C57BL6 उंदरांसह केली गेली ज्यामुळे अगौटी कोट रंगाची संतती ओळखली गेली.जीन ट्रॅप वेक्टर इन्सर्टची उपस्थिती हेटरोजायगोट्स ओळखण्यासाठी वापरली गेली.129/REJ;C57BL6 च्या मिश्र पार्श्वभूमीवर उंदरांना ठेवले होते.RT-PCR, जीनोम सिक्वेन्सिंग आणि अनुवांशिक पूरकता (पूरक आकृती 1) द्वारे अनुवांशिक ट्रॅप वेक्टरच्या प्रवेश साइटच्या स्थानाची पुष्टी केली गेली.दुहेरी हेटरोजिगस Specc1lGT उंदरांच्या CNCC वंशाचा शोध घेण्यासाठी, ROSAmTmG (#007576) आणि Wnt1-Cre (#003829) उंदीर (जॅक्सन लॅबोरेटरी, बार हार्बर, ME) ओलांडून ROSAmTmG आणि Wnt1-Crecel muse मधील एम्बेडंट तयार केले गेले.कॅन्सस मेडिकल सेंटर युनिव्हर्सिटीच्या इन्स्टिट्यूशनल अॅनिमल केअर अँड यूज कमिटीने मंजूर केलेल्या प्रोटोकॉलनुसार उंदरावरील सर्व प्रयोग केले गेले.
खोलीच्या तपमानावर 60 मिनिटांसाठी भ्रूण (1% फॉर्मल्डिहाइड, 0.2% ग्लुटाराल्डिहाइड, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) मध्ये निश्चित केले गेले.एक्स-गॅल स्टेनिंग सोल्युशनमध्ये फिक्सेशन केल्यानंतर (5 मिमी पोटॅशियम फेरीसायनाइड, 5 मिमी पोटॅशियम फेरोसायनाइड, 2 मिमी एमजीसीएल2, 0.01% सोडियम डीऑक्सीकोलेट, 0.02% एनपी-40, 1 मिलीग्राम/मिली एक्स-गॅल) डागांचा विकास 3 डिग्री सेल्सियस येथे केला गेला. .1-6 तासांच्या आत °C.भ्रूण 4% PFA मध्ये पोस्ट-फिक्स केले गेले आणि व्हिज्युअलाइज केले गेले.
वेस्टर्न ब्लॉटिंगसाठी, पेशी निष्क्रिय लिसिस बफर (प्रोमेगा, फिचबर्ग, डब्ल्यूआय) मध्ये HALT प्रोटीज इनहिबिटर (सिग्मा-अल्ड्रिच, सेंट लुईस, एमओ) च्या मिश्रणासह पूरक होते.Lysates 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX रेडीमेड जेल (बायो-रॅड, हरक्यूलिस, CA) वर प्रक्रिया केली गेली आणि इममोबिलॉन पीव्हीडीएफ झिल्ली (ईएमडी मिलीपोर, बिलेरिका, एमए) मध्ये हस्तांतरित केली गेली.PBS मध्ये 0.1% ट्वीन असलेल्या 5% दुधात पडदा अवरोधित केला गेला.अँटीबॉडीज रात्रभर 4 डिग्री सेल्सिअस तापमानात किंवा खोलीच्या तपमानावर एका तासासाठी उष्मायन केले जातात.फेमटो सुपरसिग्नल वेस्ट ईसीएल अभिकर्मक (थर्मो सायंटिफिक, वॉल्थम, एमए) सिग्नल निर्मितीसाठी वापरले गेले.इम्युनोस्टेनिंगसाठी, भ्रूण रात्रभर 4% PFA/PBS मध्ये निश्चित केले गेले आणि क्रायोप्रीझर्व केले गेले.1% सामान्य शेळी सीरम (थर्मो सायंटिफिक, वॉल्थम, एमए) आणि 0.1% ट्रायटन X-100 (सिग्मा-अल्ड्रिच, सेंट लुईस, एमओ) असलेले पीबीएसमध्ये टिश्यू क्रायसेक्शन अवरोधित केले गेले आणि नंतर इनक्यूबेटरमध्ये 4°C वर उष्मायन केले गेले. रात्रीअँटीबॉडी आणि फ्लोरोसेंट दुय्यम प्रतिपिंड (1:1000) सह 1 तास 4°C वर.डाग असलेले विभाग प्रोलाँग गोल्ड मिडीयम (थर्मो सायंटिफिक, वॉल्थम एमए) मध्ये ठेवण्यात आले होते आणि लीका टीसीएस एसपीई कॉन्फोकल मायक्रोस्कोप वापरून सपाट प्रतिमा प्राप्त केल्या गेल्या.प्रत्येक इम्युनोस्टेनिंग किमान दोन उत्परिवर्ती भ्रूणांच्या सिरोसेक्शनवर तीन स्वतंत्र प्रयोग म्हणून केले गेले.प्रातिनिधिक प्रयोग दाखवला आहे.
पेशी सुधारित RIPA बफर (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% ग्लिसरॉल, 2 mM EDTA, आणि HALT प्रोटीज इनहिबिटर (सिग्मा-अल्ड्रिच, सेंट लुई) मध्ये उष्मायन केले गेले. थोडक्यात, लाइसेट्स प्रोटीन G चुंबकीय मणी (लाइफ टेक्नॉलॉजीज, कार्ल्सबॅड, CA) सह पूर्वशुद्ध केले गेले आणि नंतर 4° C वर रात्रभर उबवले गेले. अँटी-SPECC1L किंवा IgG प्रोटीन G प्रोटीन मणी SPECC1L काढण्यासाठी वापरण्यात आले आणि अँटी वापरून वेस्टर्न ब्लॉटिंग केले गेले. वर वर्णन केलेले -β-केटेनिन अँटीबॉडी दाखवलेले सह-आयपी प्रयोग चार स्वतंत्र प्रयोगांचे प्रतिनिधी आहेत.
कन्सास मेडिकल सेंटर विद्यापीठातील इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी केंद्राला स्थिर संवर्धित पेशी किंवा माऊस भ्रूण ऊतक प्रदान करण्यात आले.थोडक्यात, नमुने EMbed 812 रेजिन (इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी सायन्सेस, फोर्ट वॉशिंग्टन, PA) मध्ये एम्बेड केले गेले होते, रात्रभर 60°C वर पॉलिमराइज्ड केले गेले आणि डायमंड ब्लेडने सुसज्ज Leica UC7 अल्ट्रामायक्रोटोम वापरून 80 nm वर विभागले गेले.100 kV लॅब6 गनसह सुसज्ज JEOL JEM-1400 ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोप वापरून विभागांची कल्पना केली गेली.
हा लेख कसा उद्धृत करावा: विल्सन, एनआर आणि इतर.SPECC1L च्या कमतरतेमुळे कापलेल्या सांध्याची स्थिरता वाढते आणि क्रॅनियल न्यूरल क्रेस्ट पेशींचे विघटन कमी होते.विज्ञान6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
सेंट-जीन, जे.-पी.न्यूरल क्रेस्टचे प्रेरण आणि भिन्नता.(स्प्रिंगर सायन्स + बिझनेस मीडिया; लँडेस बायोसायन्स/Eurekah.com, 2006).
कॉर्डेरो, DR आणि इतर.क्रॅनियल न्यूरल क्रेस्ट पेशी गतीमध्ये: क्रॅनिओफेशियल विकासात त्यांची भूमिका.अमेरिकन जर्नल ऑफ मेडिकल जेनेटिक्स.भाग A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
बोलंड, आरपी न्यूरोक्रिस्टोपॅथिया: 20 वर्षांमध्ये त्याची वाढ आणि विकास.बालरोगतज्ञ.पॅथॉलॉजीप्रयोगशाळाऔषध.17, 1-25 (1997).
मँगोल्ड ई., लुडविग केयू आणि नोटेन एमएम ब्रेकथ्रू ऑरोफेसियल क्लेफ्ट्सच्या अनुवांशिकतेमध्ये.आण्विक औषध 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011) मध्ये ट्रेंड.
मिनु, एम. आणि रिले, एफएम क्रॅनियल न्यूरल क्रेस्ट सेल मायग्रेशन आणि क्रॅनिओफेशियल डेव्हलपमेंट दरम्यान पॅटर्निंगची आण्विक यंत्रणा.विकास 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
डिक्सन, एमजे, मराझिटा, एमएल, बीटी, टीएच आणि मरे, जेके क्लेफ्ट लिप आणि पॅलेट: अनुवांशिक आणि पर्यावरणीय प्रभाव समजून घेणे.नैसर्गिक टिप्पणी.जेनेटिक्स 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
इंग्राम, सीआर आणि इतर.इंटरफेरॉन-रेग्युलेटिंग फॅक्टर -6 (Irf6) मध्ये त्वचा, हातपाय आणि क्रॅनिओफेशियल क्षेत्राचे असामान्य मॉर्फोजेनेसिस - कमतरता असलेल्या उंदरांमध्ये.राष्ट्रीय जेनेट.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.GRHL3 मधील प्रबळ उत्परिवर्तन व्हॅन डर वॉर्ड सिंड्रोमला कारणीभूत ठरतात आणि तोंडी पेरीडर्मचा विकास कमी करतात.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
हॅरिस, एमजे आणि ज्युरिलोफ, डीएम न्यूरल ट्यूब बंद होण्याच्या दोषांसह माऊस उत्परिवर्तींची यादी अद्यतनित करा आणि न्यूरल ट्यूब बंद होण्याच्या संपूर्ण अनुवांशिक समजाकडे प्रगती करा.जन्मजात दोषांची तपासणी.भाग A, क्लिनिकल आणि आण्विक टेराटोलॉजी 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA आणि Soriano, P. PI3K-मध्यस्थ PDGFRalpha सिग्नलिंग p53-आश्रित इंट्रासेल्युलर मार्गाद्वारे कंकाल विकासामध्ये अस्तित्व आणि प्रसार नियंत्रित करते.जनुक विकास 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
कोप, एजे, ग्रीन, एनडी आणि मर्डोक, जेएन डिशेव्हल्ड: रिलेशन ऑफ कन्व्हर्जंट एक्सपेन्शन टू न्यूरल ट्यूब क्लोजर.न्यूरोलॉजी मध्ये ट्रेंड.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).