347 स्टेनलेस स्टील कॉइल केलेले ट्यूबिंग रासायनिक घटक, क्रॉस-लिंक्ड मास स्पेक्ट्रोमेट्री (सीएलएमएस) वापरून कादंबरी इंटरफेरॉन-प्रतिसाद मानवी ल्यूकोसाइट प्रतिजन-ए (एचएलए-ए) चेपेरोन प्रोटीनची ओळख

Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद.तुम्ही मर्यादित CSS समर्थनासह ब्राउझर आवृत्ती वापरत आहात.सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये सुसंगतता मोड अक्षम करा).याव्यतिरिक्त, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही शैली आणि JavaScript शिवाय साइट दर्शवतो.
प्रति स्लाइड तीन लेख दर्शवणारे स्लाइडर.स्लाइड्समधून जाण्यासाठी मागील आणि पुढील बटणे वापरा किंवा प्रत्येक स्लाइडमधून जाण्यासाठी शेवटी स्लाइड कंट्रोलर बटणे वापरा.

उत्पादन वर्णन

स्टेनलेस स्टील 347L कॉइल ट्यूब, स्टील ग्रेड: SS347L

इंटरफेरॉन सिग्नलिंग सिस्टीम वातावरणातील रोगजनक आणि आंतरिक पॅथॉलॉजिकल सिग्नलच्या विस्तृत श्रेणीला एक मजबूत साइटोकाइन प्रतिसाद प्रेरित करते, परिणामी इंटरफेरॉन-इन्ड्युसिबल प्रथिनांचे उपसमूह समाविष्ट होतात.इंटरफेरॉन-प्रेरित प्रथिनांच्या डोमेनमध्ये नवीन प्रोटीन-प्रोटीन परस्परसंवाद शोधण्यासाठी आम्ही DSS-मध्यस्थ क्रॉस-लिंक मास स्पेक्ट्रोमेट्री (CLMS) लागू केली.अपेक्षित इंटरफेरॉन-इंड्युसिबल प्रथिनांच्या व्यतिरिक्त, आम्ही MX1, USP18, OAS3 आणि STAT1 सारख्या कॅनोनिकल इंटरफेरॉन-इंड्युसिबल प्रथिनांचे नवीन इंटरमॉलिक्युलर आणि इंट्रामोलेक्युलर क्रॉस-लिंक्ड अॅडक्ट्स देखील ओळखले.आम्ही को-इम्युनोप्रीसिपीटेशन वापरून HLA-A प्रोटीन्स (H2BFS-HLA-A-HMGA1) द्वारे तयार केलेल्या इंटरफेरॉन-इन्ड्युसिबल प्रोटीन नेटवर्कच्या नवीन संचाच्या ऑर्थोगोनल प्रमाणीकरणावर आणि आण्विक डायनॅमिक्स मॉडेलिंग वापरून त्यांच्या पुढील अभ्यासावर लक्ष केंद्रित केले.प्रोटीन कॉम्प्लेक्सच्या रचनात्मक गतिशीलतेच्या मॉडेलिंगने अनेक परस्परसंवाद साइट्स उघड केल्या ज्या CLMS निष्कर्षांमध्ये ओळखल्या गेलेल्या परस्परसंवादांना प्रतिबिंबित करतात.एकत्रितपणे, आम्ही इंटरफेरॉनद्वारे प्रेरित नवीन सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स ओळखण्यासाठी CLMS चा प्रायोगिक अभ्यास सादर करतो आणि ट्यूमर सूक्ष्म वातावरणातील प्रथिने परस्परसंवादाची नवीन गतिशीलता ओळखण्यासाठी CLMS च्या व्यापक वापराची अपेक्षा करतो.
अनुकूली प्रतिकारक प्रतिक्रिया सुरू होण्यापूर्वी, यजमानाची जन्मजात संरक्षण प्रणाली इंटरफेरॉन (IFNs) नावाच्या स्रावित अल्फा-हेलिकल साइटोकाइन्सच्या कुटुंबाद्वारे मध्यस्थी करून प्रतिजैविक प्रतिक्रिया माउंट करते.प्रकार I IFN वर्ग IFNα आणि IFNβ सेल्युलर प्रतिसाद सक्रिय करतात, ज्यामध्ये अँटीव्हायरल, प्रोआपोप्टोटिक, प्रोइनफ्लेमेटरी आणि अँटीप्रोलिफेरेटिव्ह अवस्था समाविष्ट आहेत.मानवांमध्ये, IFNα चे 13 उपप्रकार ज्ञात आहेत, ते सर्व गुणसूत्र 91 वर क्लस्टर केलेले आहेत. आश्चर्याची गोष्ट म्हणजे, क्लिनिकल वापरासाठी फक्त IFNα2 चा अभ्यास केला गेला आहे.अलीकडे, IFNα च्या इतर उपप्रकारांवर संशोधन करण्यासाठी विशेष लक्ष दिले गेले आहे.अलीकडील अभ्यासात असे दिसून आले आहे की IFNα14 हे प्रमाणिक IFNα2 उपप्रकाराच्या तुलनेत HBV2 आणि HIV-13,4 प्रतिकृती प्रतिबंधित करण्यासाठी सर्वात प्रभावी आयसोफॉर्म्सपैकी एक आहे.
हे स्थापित केले गेले आहे की सक्रिय प्रकार I इंटरफेरॉन रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स (IFNAR1 आणि IFNAR2) जेनस किनासेस TYK2 आणि JAK15,6 द्वारे मध्यस्थ सिग्नल ट्रान्सडक्शन कॅस्केड ट्रिगर करतात.हे जॅनस किनेस फॉस्फोरीलेट सिग्नल ट्रान्सड्यूसर आणि ट्रान्सक्रिप्शनल प्रोटीन अॅक्टिव्हेटर्स (STAT1 आणि STAT2) टायरोसिन अवशेषांवर SH2 डोमेन-मध्यस्थ हेटरोडाइमेरायझेशन सुरू करतात.त्यानंतर, IRF9 STAT heterodimers ला IFN-stimulated factor 3 जनुक (ISGF3) चे ट्रिमेरिक कॉम्प्लेक्स तयार करण्यासाठी बांधते, जे न्यूक्लियसमध्ये स्थानांतरित होते आणि 2000 पेक्षा जास्त इंटरफेरॉन-उत्तेजित जनुकांचे (ISGs, 5,6,7,6,7) प्रतिलेखन करते.
ISGs जन्मजात रोगप्रतिकारक प्रणालीचा कणा बनवतात, विशेषत: विषाणूंच्या हल्ल्याला प्रतिसाद म्हणून.विषाणूजन्य संसर्गाविरूद्ध संरक्षणाची पहिली ओळ म्हणून, पेशी वेगाने विस्तृत जैविक क्रियाकलापांसह सेल्युलर प्रथिनांचे विस्तृत परस्परसंवाद तैनात करतात.या प्रथिनांमध्ये पॅटर्न रेकग्निशन रिसेप्टर्स, सिग्नलिंग रेणू, ट्रान्सक्रिप्शन घटक आणि थेट अँटीव्हायरल फंक्शन्स असलेले प्रथिने, तसेच रोगप्रतिकारक प्रतिक्रियांचे नकारात्मक नियामक यांचा समावेश होतो.ISG क्रियाकलापावरील बरीचशी माहिती ओव्हरएक्सप्रेशन स्क्रीन्स 10,11 किंवा जनुक सायलेंसिंग तंत्र (siRNA, RNAi आणि CRISPR) 12,13 वापरून फंक्शनल स्क्रीनमधून येते ज्यामध्ये वैयक्तिक ISG व्यक्त किंवा प्रतिबंधित केले जातात आणि त्यांच्या क्रियाकलापांची विविध व्हायरसवर चाचणी केली जाते.जरी या अभ्यासांनी वैयक्तिक ISG चे अँटीव्हायरल गुणधर्म निश्चित केले असले तरी, प्रत्येक ISG च्या अंतर्निहित आण्विक यंत्रणा मोठ्या प्रमाणात अज्ञात आहेत.हे सामान्यतः स्वीकारले जाते की संपूर्ण क्रियाकलाप सुनिश्चित करण्यासाठी अनेक प्रथिने एक किंवा अधिक साइटोकाइन्सशी संवाद साधतात, म्हणून एकतर ISG थेट संवाद साधतात किंवा त्यांचे परस्परसंवाद सेल्युलर प्रोटीनद्वारे मध्यस्थी करतात.उदाहरणार्थ, अलीकडील फोटोक्रॉसलिंक प्रोटिओमिक्स अभ्यासाने ATPase VCP/p97 हे प्रमुख IFITM3 परस्परसंवाद भागीदार म्हणून ओळखले, ज्याच्या प्रतिबंधामुळे लाइसोसोमल सॉर्टिंग, टर्नओव्हर आणि IFITM3 चे व्हायरल कण 14 सह ट्रान्सपोर्टमध्ये दोष निर्माण होतात.इम्युनोप्रीसिपीटेशन वापरून, आम्ही VAPA, एक वेसिकल-संबंधित प्रोटीन ओळखले, IFITM1/2/3 सह परस्परसंवाद भागीदार म्हणून ओळखले जे कोलेस्टेरॉल-मध्यस्थ विषाणू परिपक्वतामध्ये मध्यस्थी करते, आणि यीस्ट टू-हायब्रिड प्रणाली वापरून दुसर्या अभ्यासाद्वारे याची पुष्टी केली गेली.वैज्ञानिक समर्थन 15 , 16 .
संसर्ग आणि घातक परिवर्तनाच्या दडपशाहीमध्ये गुंतलेली एक मूलभूत जैविक प्रक्रिया म्हणजे प्रतिजन सादरीकरण, जी मुख्य हिस्टोकॉम्पॅटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (MHC) रेणूंद्वारे मध्यस्थी केली जाते.पेप्टाइड्स (8-12 एमिनो अॅसिड लांब) क्लीव्ह केलेले, अकाली संपुष्टात आलेले किंवा चुकीचे फोल्ड केलेले प्रोटीन MHC-I हेटरोडाइमरमध्ये लोड केले जातात (MHC-I जड आणि हलकी साखळी, ज्याला β-2-मायक्रोग्लोबुलिन म्हणतात; β2M) 17,18 .परिणामी स्थिर MHC-I ट्रायमर सेलच्या पृष्ठभागावर नेले जातात, जिथे ते CD8+ T पेशी (साइटोटॉक्सिक टी पेशी) 17 मध्ये इंट्रासेल्युलर पेप्टाइड्स सादर करतात.टी पेशी हे रोगजनक आणि ट्यूमर-विशिष्ट प्रतिजन वाहून नेणाऱ्या पेशी ओळखतात आणि नष्ट करतात.परिणामी, रोगकारक आणि ट्यूमर पेशी रोगप्रतिकारक निरीक्षण टाळण्यासाठी प्रतिजन सादरीकरण प्रक्रिया दडपतात.याव्यतिरिक्त, मानवी ट्यूमरच्या 40-90% मध्ये MHC-I कमी केले जाते आणि बहुतेक वेळा गरीब रोगनिदानाशी संबंधित असते.
रोगजनकांना प्रतिसाद देण्‍यात गुंतलेली जीन्स विश्रांतीची स्थिती आणि सक्रिय लिप्यंतरणाची स्थिती यांच्यात त्वरीत स्विच करणे आवश्यक आहे.म्हणून, प्रमोटर क्रोमॅटिन 20,21 चे रीमॉडेलिंग आणि सुधारणांसह, अल्प कालावधीत उच्च IFN मागणीच्या प्रतिसादात अनेक सेल्युलर प्रथिने सामील असल्याचे गृहित धरले जाते.बहुतेक अभ्यासांनी IFN च्या उपस्थितीत वैयक्तिक ISG प्रोटीन भागीदारांच्या ओळखीवर लक्ष केंद्रित केले आहे.मॉडेल सेल सिस्टममधील अनेक प्रोटीओमिक आणि ट्रान्सक्रिप्टोमिक अभ्यासांनी सेल्युलर लँडस्केपवर IFN चा प्रभाव स्पष्ट केला आहे.तथापि, इंटरफेरॉनद्वारे प्रेरित गतिशीलतेची वाढती समज असूनही, आम्हाला अजूनही ISG च्या सहभागाबद्दल फारसे माहिती नाही.इंटरफेरॉन सिग्नलिंगची जटिलता आणि वेळ-आश्रित गतिशीलता लक्षात घेता, दोन प्रश्न उद्भवतात: (i) जलद सिग्नलिंगमध्ये गुंतलेल्या मल्टीप्रोटीन कॉम्प्लेक्सला स्थिर करणे आणि अडकवणे शक्य आहे का आणि (ii) या परस्परसंवादांना 3D स्पेसमध्ये मॅप केले जाऊ शकते का?
या समस्यांचे निराकरण करण्यासाठी, आम्ही IFNα-प्रेरित प्रोटीन परस्परसंवाद नेटवर्क आणि त्याच्या गतिशीलतेचा अभ्यास करण्यासाठी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (CLMS) सोबत डिस्किनिमाइड सबरेट-मध्यस्थ केमिकल क्रॉस-लिंकिंग (DSS) लागू केले.डीएसएस विवोमधील प्रथिनांचे प्रॉक्सिमल अवशेष आणि/किंवा प्रोटीन कॉम्प्लेक्स दरम्यान सहसंयोजक बंध जोडते.त्यानंतरचे MS विश्लेषण विशिष्ट क्रॉसलिंकिंग साइट्स प्रकट करते जे विशिष्ट प्रथिनांमधील क्षेत्रांच्या स्थानिक समीपतेचे प्रतिबिंबित करतात, ज्याला अंतर्गत संबंध म्हणतात, किंवा प्रोटीन कॉम्प्लेक्समधील सबयुनिट्स, ज्याला परस्परसंबंध म्हणतात.हा दृष्टिकोन वापरून, आम्ही अनेक नवीन प्रथिने-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स तसेच इंटरफेरॉन-प्रेरित मल्टीप्रोटीन परस्परसंवाद नेटवर्क ओळखले आहेत.या नवीन परस्परसंवादांच्या उपसंचाची पुढील चाचणी करून, आम्ही हे दाखवून देतो की H2BFS (H2B हिस्टोन-प्रकार FS; यापुढे H2B म्हणून संदर्भित) आणि MDN1 HLA-A साठी बंधनकारक भागीदार म्हणून कार्य करतात.
Flo-1 पेशी अन्ननलिका एडेनोकार्सिनोमाच्या विट्रो मॉडेल्समध्ये सर्वात प्रसिद्ध आहेत कारण ते एसोफेजियल ट्यूमर 22,23 च्या मुख्य वैशिष्ट्यांची नक्कल करतात.तथापि, सर्व ट्यूमर इम्युनोजेनिक नसतात आणि Flo-1 पेशी इंटरफेरॉन उपचारांना प्रतिसाद देतात की नाही हे निर्धारित करण्यासाठी, आम्ही Flo-1 पेशींवर 10 ng/ml IFNα सह 72 तास उपचार केले.Flo-1 पेशींनी pSTAT1 आणि IRF1 चे लवकर इंडक्शन दर्शविले, उपचारानंतर 2 तासांनी सुरू होते आणि IRF1 (आकृती 1A) च्या स्थिर पातळीमध्ये वेळेवर अवलंबून घट होऊन 72 तास चालू होते.ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2, आणि ISG15) IFNα (आकृती 1A) च्या क्लासिक मध्य आणि शेवटच्या टप्प्यातील प्रतिसादांची नक्कल करून, 6 तासांनंतर जोरदारपणे प्रेरित असल्याचे आढळले.एकत्रितपणे, हे डेटा सूचित करतात की हे सेल्युलर मॉडेल इंटरफेरॉन प्रतिसादांचा अभ्यास करण्यासाठी वापरले जाऊ शकते.
IFNα उपचारानंतर Flo-1 पेशींमध्ये भिन्न प्रोटीन अभिव्यक्ती प्रतिसाद.(A) 2, 6, 24, 48 आणि 72 तासांसाठी 10 ng/ml IFNα सह उपचार केलेल्या Flo-1 पेशींमधील प्रथिन अभिव्यक्तीचे संकेतित ISG प्रतिपिंडे वापरून इम्युनोब्लॉटद्वारे विश्लेषण केले गेले.(B) सूचित वेळा आणि एकाग्रतेसाठी DSS सह क्रॉस-लिंक केल्यानंतर संपूर्ण सेलच्या अर्कांचे कूमासी ब्लू स्टेन्ड SDS-PAGE जेल.(C) प्रथिने क्रॉस-लिंकिंगच्या डिग्रीचे मूल्यांकन करण्यासाठी त्याच नमुन्यांमधील p53(DO-1) प्रतिपिंडासह प्रतिनिधी इम्युनोब्लॉटची तपासणी केली.
इन सिटू प्रोटीन इंटरअॅक्शन लँडस्केप कॅप्चर करण्यासाठी, आम्ही डीएसएस वापरला, जो मोठ्या प्रमाणात वापरला जाणारा क्रॉस-लिंकिंग एजंट त्याच्या उच्च झिल्ली पारगम्यता आणि तुलनेने कमी प्रतिक्रिया वेळेमुळे.कमी प्रतिक्रियेचा वेळ क्रॉसलिंक केलेल्या प्रथिनांच्या मोठ्या समुच्चयांच्या निर्मितीस प्रतिबंध करण्यास मदत करतो, ज्यामुळे क्रॉसलिंकरची स्थिरता राखली जाते.इष्टतम DSS एकाग्रता निश्चित करण्यासाठी आणि ओव्हर-क्रॉसलिंकिंग टाळण्यासाठी, आम्ही प्रथम सेल 5, 2.5, आणि 1 mM DSS वर अनुक्रमे 5, 10, 5 आणि 30 मिनिटांसाठी उघड केले आणि Coomassie-stained SDS-PAGE द्वारे लाइसेट्सचे विश्लेषण केले. (डेटा दर्शविला नाही).सेल लाइसेट्स सर्वात कमी एकाग्रतेवर आणि सर्वात कमी वेळेत अत्यंत क्रॉस-लिंक केलेले दिसतात.म्हणून, DSS 5 मिनिटांत 1, 0.5, आणि 0.1 mM वर टायट्रेट केले गेले (आकृती 1B).0.5 mM DSS सह 5 मिनिटांसाठी इष्टतम क्रॉसलिंकिंग दिसून आले आणि IFNα सह उपचार केलेल्या पेशींसाठी या अटी निवडल्या गेल्या.याव्यतिरिक्त, आकृती 1C प्रोटीन क्रॉस-लिंकिंगच्या डिग्रीचे मूल्यांकन करण्यासाठी p53 (DO-1) अँटीबॉडी वापरून केलेले एक वेस्टर्न ब्लॉट दाखवते.
क्रॉसलिंकर जोडण्यापूर्वी 24 तास Flo-1 पेशींवर 10 ng/ml IFNα उपचार केले गेले.क्रॉस-लिंक केलेल्या पेशी नंतर दोन-चरण प्रोटीओलिसिसद्वारे लाइझ केल्या गेल्या आणि FASP (चित्र 2) 24,25 द्वारे प्रथिने प्रक्रिया केली गेली.क्रॉस-लिंक्ड ट्रायप्टिक पेप्टाइड्सचे मास स्पेक्ट्रोमेट्री (चित्र 2) द्वारे विश्लेषण केले गेले.MS/MS स्पेक्ट्रा नंतर प्रथिन क्रमाशी जुळतात आणि MaxQuant26,27 सह परिमाणित केले जातात.SIM-XL प्रोग्राम वापरून प्राप्त केलेल्या स्पेक्ट्रामधून क्रॉस-लिंक केलेले पेप्टाइड्स ओळखले गेले आणि xQuest28 आणि SIM-XL29 ओपन सोर्स कॉम्प्युटिंग सॉफ्टवेअर पाइपलाइन (चित्र 2) वापरून वैयक्तिक संयुगे एका जटिल नेटवर्कमध्ये एकत्र केले गेले.सिम-एक्सएल प्रथिने-प्रोटीन परस्परसंवाद, अंतर्गत साखळी आणि वैयक्तिक साखळी साध्या किंवा जटिल प्रथिन मिश्रणांमध्ये ओळखते आणि प्रथिने संरचनांमधील परस्परसंवाद दृश्यमान करण्यासाठी स्क्रिप्ट प्रदान करते.याव्यतिरिक्त, ते प्रत्येक क्रॉस-रेफरन्सला MS/MS29 स्पेक्ट्रम गुणवत्तेनुसार आयडी स्कोअर म्हणून रँक करते.अनेक अत्यंत विश्वासार्ह प्रथिने-प्रथिने परस्परसंवाद आणि कॉम्प्लेक्स ओळखले गेले आहेत आणि परस्परसंवादाचा एक नवीन संच को-इम्युनोप्रीसिपिटेशन आणि मॉलिक्युलर डायनॅमिक्स (MD) मॉडेलिंग (Fig. 2) 30, 31 वापरून कॉम्प्लेक्सच्या संरचनात्मक बदलांचा वापर करून तपासला गेला आहे.
CLMS पद्धतीचे योजनाबद्ध विहंगावलोकन.Flo-1 पेशींवर 10 ng/ml IFNα ने 24 तास उपचार केले गेले, त्यानंतर डीएसएस वापरून सिटू प्रोटीन क्रॉस-लिंकिंग आणि त्यानंतर सेल लिसिस आणि ट्रायप्सिनायझेशन केले गेले.क्रॉस-लिंक केलेले नमुने ऑर्बिट्रॅप मास स्पेक्ट्रोमीटर वापरून विश्लेषित केले गेले आणि पुढे एलसी-एमएस/एमएस दरम्यान पेप्टाइड प्रिकर्सर्सच्या विखंडनासाठी नमुना घेण्यात आला.क्रॉसलिंक्ड पेप्टाइड्स (SIM-XL) प्रोग्रामच्या स्पेक्ट्रम रेकग्निशन मशीनचा वापर करून प्राप्त केलेल्या स्पेक्ट्रामधून दोन जोडलेले पेप्टाइड्स ओळखले गेले आणि सर्व संयुगे संगणकीय पाइपलाइन वापरून एका जटिल नेटवर्कमध्ये एकत्र केले गेले.खोट्या सकारात्मक दर (FDR) स्कोअरवर आधारित कमी आत्मविश्वास संवाद फिल्टर करा.को-इम्युनोप्रेसिपीटेशन वापरून अनेक नवीन उच्च-विश्वस्त प्रथिने-प्रोटीन परस्परसंवादाची पुष्टी केली गेली आणि आण्विक डायनॅमिक्स (MD) मॉडेलिंग वापरून कॉम्प्लेक्समधील संरचनात्मक बदलांचे परीक्षण केले गेले.
एकूण ~30,500 आणि ~28,500 पेप्टाइड्स अनुक्रमे उत्तेजित आणि उत्तेजित IFNα नमुन्यांमध्ये MaxQuant वापरून आढळून आले (पूरक तक्ता S1, Fig. 3A).दोन्ही प्रकरणांमध्ये पेप्टाइड लांबीच्या वितरणामध्ये मोठ्या पेप्टाइड्सचे उच्च प्रमाण दिसून आले, जे क्रॉस-लिंक्ड पेप्टाइड्सची उपस्थिती दर्शविते (चित्र 3B,C).याव्यतिरिक्त, IFNα-उपचार केलेल्या नमुन्यांमध्ये (Fig. 3C) 40-55 श्रेणीमध्ये मोठ्या पेप्टाइड्सचे मोठे प्रमाण उपस्थित होते.लॉग2 तीव्रतेच्या विरूद्ध प्रथिने मॅपिंगने दर्शविले की क्लासिक इंटरफेरॉन-उत्तेजित प्रथिने उपचार न केलेल्या नमुन्यांच्या तुलनेत सर्वाधिक मुबलक आहेत, ज्यात MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, आणि HLA-F (आकृती 3D) यांचा समावेश आहे.रिएक्टोम पाथवे डेटाबेसचा वापर करून IFNα उपचारांच्या प्रतिसादात तीन पट पेक्षा अधिक समृद्ध प्रथिनांसाठीच्या मार्गांचे विश्लेषण असे दर्शविते की MHC-I-मध्यस्थ प्रतिजन सादरीकरण आणि प्रक्रिया हा सर्वात प्रभावी मार्ग होता (आकृती 3E).पूर्वीच्या अहवालांशी सुसंगत, OAS आणि ISG15 द्वारे मध्यस्थी केलेले अँटीव्हायरल प्रतिसाद तसेच IFNα/β आणि साइटोकाइन सिग्नलिंग सक्रिय केलेल्या मार्गांपैकी होते.याव्यतिरिक्त, सिम-एक्सएल वापरून मूळ अधिग्रहित एमएस/एमएस स्पेक्ट्रामधून लाइसिन- आणि सेरीन-विशिष्ट प्रोटीन क्रॉस-लिंक ओळखले गेले.अलीकडील अभ्यासात 5 पेशी प्रकारांमध्ये वैयक्तिक ISG ओव्हरएक्सप्रेशन अभ्यासाच्या मेटा-विश्लेषणाद्वारे 9 विषाणू वर्गांमधून 20 व्हायरस पसरलेल्या 104 ISGs ची नोंद झाली आहे9.तथापि, मोठ्या डेटासेटच्या स्क्रीनिंगच्या संगणकीय मर्यादांवर मात करण्यासाठी, आम्ही पडरिया एट अल. द्वारे नोंदवलेल्या IRDS जनुकांच्या सूचीमधील संभाव्य परस्परसंवाद शोधण्यासाठी एका लहान डेटासेटसह सुरुवात केली, ज्यापैकी बहुतेक ISG आहेत.
IFNα (MaxQuant वरून प्राप्त केलेला डेटा) च्या प्रतिसादात भिन्न व्यक्त क्रॉस-लिंक केलेल्या प्रथिनांची ओळख.(A) IFNα14 उपचारित आणि उपचार न केलेल्या Flo-1 नमुन्यांमध्ये ओळखल्या गेलेल्या सामान्य आणि अनन्य पेप्टाइड्सच्या संख्येचे प्रतिनिधित्व करणारा Venn आकृती.उपचार न केलेले (B) आणि IFNα उपचारित (C) क्रॉसलिंक केलेले नमुने पेप्टाइड लांबीचे वितरण.(D) उपचार न केलेल्या आणि IFNα14 उपचारित Flo-1 पेशींमध्ये लॉग2 (LFQ तीव्रता) दर्शविणारा उष्णता नकाशा.डाव्या पॅनेलमध्ये IFNα च्या उपस्थितीत प्रथिने सर्वात सक्रियपणे सक्रिय होतात.(ई) IFNα उपचारानंतर 20 प्रमुख समृद्धी मार्गांचे प्रतिनिधित्व करणारा हिस्टोग्राम.रिएक्टोम पाथवे डेटाबेसने अपरेग्युलेटेड IFNα-रिस्पॉन्सिव्ह प्रोटीन्समधील चार पटापेक्षा जास्त बदलांचे विश्लेषण केले.
इंटरफेरॉन-मध्यस्थ ISG उत्तेजित होणे चांगले दस्तऐवजीकरण केले आहे, परंतु आण्विक स्तरावर हे प्रथिने जैविक कार्यांच्या विस्तृत श्रेणीमध्ये कसे पराकाष्ठा करतात हे फारसे समजलेले नाही.आम्ही ज्ञात ISGs दरम्यान उच्च आत्मविश्वासाने प्रथिने परस्परसंवादाची तपासणी केली.विशेष म्हणजे, आम्ही MX1, USP18, ROBO1, OAS3 आणि STAT1 प्रथिनांसह नेटवर्क ओळखले जे IFNα उपचार (आकृती 4, टेबल S2) 32,33,34 च्या प्रतिसादात एक मोठे कॉम्प्लेक्स तयार करते.सर्वात महत्त्वाचे म्हणजे, हे परस्परसंवाद IFNα सह उपचार केलेल्या सर्व त्रिगुणांमध्ये आढळले आणि उपचार न केलेल्या नमुन्यांमध्ये आढळले नाहीत, असे सूचित करतात की ते विशेषतः IFNα उपचारांच्या प्रतिसादात तयार केले गेले होते.हे ज्ञात आहे की STAT1 लिप्यंतरितपणे या ISGs च्या अभिव्यक्तीचे नियमन करते, परंतु प्रथिने स्तरावर ISGs सोबत त्याचा परस्परसंवाद अभ्यासला गेला नाही.STAT1 च्या क्रिस्टल स्ट्रक्चरने दर्शविले की त्याचे हेलिकल डोमेन (CCD) डायमर्स 35 च्या निर्मिती दरम्यान डीएनए किंवा प्रोटोमर्सशी परस्परसंवादात गुंतलेले नाही.हे α-हेलिसेस एक हेलिकल हेलिक्स रचना बनवतात जी मुख्यतः हायड्रोफिलिक पृष्ठभागाचे क्षेत्रफळ प्रदान करते.आमच्या सीएलएमएस डेटामध्ये, आम्ही निरीक्षण केले आहे की STAT1 सह बहुतेक परस्परसंवाद सीसीडी, लिंकर डोमेन किंवा सी-टर्मिनल टेल (अवशेष 700-708) (आकृती 4A) च्या आधीच्या SH2 डोमेनमध्ये झाले आहेत.मागील अभ्यासात असे दिसून आले आहे की USP18 STAT2 च्या CCD आणि DNA-बाइंडिंग डोमेन (DBD) शी बांधील आहे आणि प्रकार I इंटरफेरॉन सिग्नलिंग 24 च्या प्रतिबंधात मध्यस्थी करण्यासाठी प्रकार I इंटरफेरॉन रिसेप्टर IFNAR2 च्या सबयुनिटमध्ये भरती आहे.आमच्या डेटाने असेही दाखवले आहे की USP18 उत्प्रेरक डोमेन STAT1 DBD (आकृती 4A,D) शी संवाद साधते, असे सूचित करते की STAT1 आणि STAT2 दोन्ही USP18 ला IFNAR2 कडे आकर्षित करण्यात भूमिका बजावू शकतात.
IFNα सह उपचार केलेल्या क्रॉस-लिंक केलेल्या पेशींमध्ये प्रोटीन-प्रोटीन ISG नेटवर्क ओळखले जाते.(A) 2D परस्परसंवाद प्लॉट प्रोटीन-प्रोटीन परस्परसंवाद दर्शवितो (SIM-XL प्रोग्राममध्ये व्युत्पन्न केलेले), इंटरमॉलिक्युलर परस्परसंवाद दर्शविणार्‍या रेषा (क्रॉसलिंक कटऑफ 3.5 वर सेट).भिन्न ओळखींचे डोमेन त्यांच्या रंग32 द्वारे चिन्हांकित केले जातात: MX1 डोमेन, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547), आणि GED (569–660).OAS3 डोमेन: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), आणि OAS1_C (903-108).डोमेन ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) आणि fn3 (777–864).STAT1 फील्ड: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), आणि STAT1_TAZ2bind (715–739).(ब) क्रॉस-लिंक केलेल्या प्रथिनांचे वर्तुळाकार दर्शक (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, आणि STAT1) अनुक्रमे निळ्या आणि लाल रंगात लेबल केलेल्या परस्परसंवादांसह.क्रॉस-लिंक थ्रेशोल्ड 3.5 वर सेट केला होता.डॉट प्लॉट्स MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), आणि OAS3 (F), तसेच दोन पेप्टाइड्समधील K किंवा S परस्परसंवाद साइट्ससह STAT1 परस्परसंवाद साइट्स दर्शवतात.आकृतीमध्ये, क्रॉस-लिंक स्कोअर थ्रेशोल्ड 3.0 वर सेट केला आहे.(G) STAT1 आणि OAS3 DI डोमेनमधील विविध परस्परसंवाद साइट्स PyMol (PyMOL आण्विक ग्राफिक्स सिस्टम, आवृत्ती 2.0 Schrödinger, LLC.) मधील त्यांच्या प्रोटीन संरचनांवर अधिभारित;STAT1 (pdb id: 1bf533) आणि OAS3 (pdb id: 4s3n34).) कार्यक्रम.
मानवामध्ये USP18 च्या दोन आयसोफॉर्म्सचे वर्णन केले गेले आहे, एक पूर्ण-लांबीचे प्रथिन जे प्रामुख्याने न्यूक्लियसमध्ये स्थित आहे आणि एन-टर्मिनल डोमेन नसलेले आयसोफॉर्म, USP18-sf, जे सायटोप्लाझम आणि न्यूक्लियस 36 मध्ये समान रीतीने वितरीत केले जाते.याव्यतिरिक्त, एन-टर्मिनस असंरचित असण्याचा अंदाज होता आणि त्याला आयसोपेप्टिडेस क्रियाकलाप किंवा ISG1537 बंधनकारक आवश्यक नाही.आमच्या अभ्यासात ओळखल्या गेलेल्या बहुतेक परस्परसंवाद प्रथिनांच्या N-टर्मिनसवर स्थित होते, जे सूचित करतात की या परस्परसंवादांमध्ये पूर्ण-लांबीचे USP18 (आकृती 4A,D) समाविष्ट आहे आणि त्यामुळे न्यूक्लियसमध्ये होण्याची शक्यता आहे.शिवाय, आमचा डेटा असेही सूचित करतो की एन-टर्मिनस प्रोटीन-टू-प्रोटीन परस्परसंवादासाठी विशेष आहे.IFNAR2 बाइंडिंग साइट अवशेष 312-368 दरम्यान स्थित आहे, आणि विशेष म्हणजे, कॉम्प्लेक्समधील कोणतेही प्रथिने या प्रदेशाशी जोडलेले नाहीत (चित्र 4A) 37,38 .एकत्र घेतलेले हे डेटा सूचित करतात की IFNAR2 बंधनकारक डोमेन केवळ रिसेप्टर प्रोटीनद्वारे वापरले जाते.याव्यतिरिक्त, केवळ OAS3 आणि ROBO1 हे N-टर्मिनस आणि IFNAR2 बाइंडिंग साइट (आकृती 4A) च्या अपस्ट्रीम डोमेनशी संबंधित असल्याचे आढळले.
ROBO1 ट्रान्समेम्ब्रेन सिग्नलिंग रेणूंच्या इम्युनोग्लोब्युलिन (Ig) सुपरफॅमिलीशी संबंधित आहे आणि त्यात पाच Ig डोमेन आणि बाह्य पेशी क्षेत्रामध्ये तीन फायब्रोनेक्टिन (Fn) डोमेन असतात.या एक्स्ट्रासेल्युलर डोमेन्समध्ये मेम्ब्रेन-प्रॉक्सिमल क्षेत्र आणि सिंगल ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिक्स 39 आहेत. एक असंरचित इंट्रासेल्युलर प्रदेश सी-टर्मिनस येथे स्थित आहे आणि त्यात संरक्षित अनुक्रम स्वरूप आहेत जे मध्यस्थ प्रभावक प्रोटीन बंधनकारक आहेत39.एमिनो अॅसिड ~1100 ते 1600 पर्यंत पसरलेला प्रदेश बहुतेक विस्कळीत आहे.आम्हाला आढळले की MX1 ROBO1 शी Ig, Fn आणि इंट्रासेल्युलर डोमेनद्वारे संवाद साधतो, तर STAT1 सह बहुतेक संवाद त्याच्या CCD, लिंकर डोमेन आणि ROBO1 (चित्र 4A,E) च्या C-टर्मिनस दरम्यान होतात.दुसरीकडे, DI, DIII, आणि OAS3 लिंकर क्षेत्रांसह परस्परसंवाद संपूर्ण ROBO1 प्रथिने (Fig. 4A) मध्ये वितरित केले गेले.
oligoadenylate synthase (OAS) प्रोटीन फॅमिली इंट्रासेल्युलर डबल-स्ट्रँडेड RNA (dsRNA) स्वीकारते आणि बांधते, रचनात्मक बदल घडवून आणते आणि 2′,5′-लिंक्ड oligoadenylates (2-5 As) 40 चे संश्लेषण करते.असे आढळून आले की तीन OAS मध्ये, OAS3 dsRNA साठी सर्वात जास्त आत्मीयता प्रदर्शित करते आणि कमीतकमी 2-5 As चे संश्लेषण करते, जे RNase L सक्रिय करू शकते आणि त्यामुळे व्हायरल प्रतिकृती 41 मर्यादित करू शकते.OAS कुटुंबामध्ये पॉलिमरेझ बीटा (pol-β) सारखी न्यूक्लियोटाइड ट्रान्सफरेज डोमेन असतात.मागील संशोधनात असे दिसून आले आहे की C-टर्मिनल डोमेन (DIII) ची उत्प्रेरक क्रिया dsRNA-बाइंडिंग डोमेन (DI) वर अवलंबून आहे, जी OAS342 सक्रिय करण्यासाठी आवश्यक आहे.आम्ही निरीक्षण केले की OAS3 चे DI आणि DII डोमेन CCD आणि SH2 आणि STAT1 TAD (आकृती 4A,F) मधील लहान जंक्शन क्षेत्राशी संवाद साधतात.प्रथिन संरचनेवर वेगवेगळ्या क्रॉसलिंकिंग साइट्स आच्छादित केल्याने β-शीट आणि DBD STAT1 लूप आणि OAS3 (Fig. 4G) च्या DI डोमेनमधील अवशेष 60-75 द्वारे तयार झालेला एक ओपन पॉकेट किंवा पोकळी यांच्यातील परस्परसंवाद दिसून आला.कॉम्प्लेक्समधील प्रथिनांच्या अभिमुखतेने हे देखील सूचित केले की OAS3 सह कोणत्याही परस्परसंवादाने त्याच्या DI डोमेन (Fig. S1A) च्या DNA-बाइंडिंग क्षमतेमध्ये हस्तक्षेप केला नाही.याव्यतिरिक्त, GTPase MX1 चे N-टर्मिनल डोमेन OAS3 (Fig. 4A) च्या DI आणि DIII डोमेनसह विस्तृतपणे संवाद साधते.आम्ही तिन्ही IFNα-उपचार केलेल्या पुनरावृत्तींमध्ये OAS1 आणि MX1 मधील परस्परसंवाद देखील पाहिला, जेथे एकाच OAS1 डोमेनने (उत्प्रेरकदृष्ट्या सक्रिय देखील) तीनही MX1 डोमेनशी संवाद साधला (आकृती S2A,B).
MX प्रथिने डायनिन सारख्या GTPases च्या मोठ्या कुटुंबाचा भाग आहेत ज्यात N-टर्मिनल GTPase डोमेन असते जे GTP ला बांधते आणि हायड्रोलायझ करते, एक इंटरमीडिएट डोमेन जे सेल्फ असेंब्ली मध्यस्थी करते आणि एक C-टर्मिनल ल्यूसीन जिपर जे GTPase (LZ) म्हणून कार्य करते. ).डोमेन प्रभावक डोमेन25,43.MX1 विषाणूजन्य जनुकाचे लिप्यंतरण अवरोधित करण्यासाठी व्हायरल पॉलिमरेसच्या उपयुनिट्सशी बांधले जाते.पूर्वी नोंदवलेल्या यीस्ट टू-हायब्रिड स्क्रीनने असे दाखवले आहे की PIAS1-संबंधित MX1 DNA-बाइंडिंग क्रियाकलाप अवरोधित करून STAT1-मध्यस्थ जनुक सक्रियता प्रतिबंधित करते आणि त्यात SUMO E344,45 ligase क्रियाकलाप देखील आहे.येथे, आम्ही हे दाखवून देतो की MX1 हे STAT1 (आकृती 4C,D) शी बंधनकारक आहे, तथापि हा परस्परसंवाद IFNα च्या प्रतिसादात STAT1-मध्यस्थ जनुक सक्रियतेवर कसा प्रभाव पाडतो याचा पुढील अभ्यास आवश्यक आहे.या व्यतिरिक्त, आम्हाला हे देखील आढळले की MX1 ने IFIT3 आणि DDX60 सह तीनही IFNα-उपचार केलेल्या पुनरावृत्तींमध्ये संवाद साधला (Fig. S2C).
DDX60 हा एक IFN-प्रेरित सायटोप्लाज्मिक हेलिकेस आहे जो पूर्वी व्हायरल RNA46 च्या RIG-I-स्वतंत्र अवनतीमध्ये भूमिका बजावत असल्याचे नोंदवले गेले आहे.हे RIG-I शी संवाद साधते आणि त्याचे सिग्नलिंग लिगँड-विशिष्ट पद्धतीने सक्रिय करते 46. DDX60 मध्ये DEXD/H-Box हेलिकेस डोमेन आणि C-टर्मिनल हेलिकेस डोमेन असते जे व्हायरल RNA आणि DNA47 ला बांधतात.MX1 आणि IFIT3 सह त्याचे बहुतेक परस्परसंवाद कॅनोनिकल डोमेन किंवा आकृतिबंधांशिवाय लांब N- आणि C-टर्मिनल क्षेत्रांमध्ये होतात (Fig. S2E,F).तथापि, MX1 देखील DEXD/H-Box हेलिकेस डोमेनशी संबंधित आहे (Fig. S2E).IFIT कुटुंबातील प्रथिनांमध्ये टेट्रापेप्टाइड रिपीट (TPR) नावाच्या विशिष्ट हेलिक्स-टर्न-हेलिक्स मोटिफच्या टँडम प्रती असतात.IFIT3 हे RIG-I सिग्नलिंगचे सकारात्मक मॉड्युलेटर असल्याचे आढळून आले आणि म्हणूनच MAVS कॉम्प्लेक्सचा एक घटक आहे.एकत्रितपणे, आमचा डेटा सूचित करतो की IFIT3 आणि DDX60 प्रामुख्याने IFIT3 च्या TPR 3-6 मधील प्रदेशात परस्परसंवाद करतात आणि RIG-I/MAVS सिग्नलिंग (Fig. S2F) मध्ये भूमिका बजावू शकतात.
संपूर्ण प्रोटीओमची तपासणी संगणकीयदृष्ट्या गहन आहे हे लक्षात घेता, आम्ही नंतर IFNα-उपचार केलेल्या पुनरावृत्तीपैकी एकाच्या उपस्थितीसाठी संपूर्ण मानवी UniProt डेटाबेस तपासला.या प्रतिकृतीमध्ये, आम्हाला HLA-A साठी अनेक अत्यंत विश्वासार्ह परस्परसंवाद नेटवर्क आढळले.MS/MS स्पेक्ट्राद्वारे ओळखल्या जाणार्‍या प्रथिने मार्गांच्या विश्लेषणात असे दिसून आले की MHC-I-आधारित प्रतिजन प्रक्रिया आणि सादरीकरण हा इंटरफेरॉन (चित्र 3D) द्वारे प्रेरित मुख्य मार्ग आहे.म्हणून, आम्ही सर्व क्रॉस-लिंक केलेल्या नमुन्यांमध्ये उच्च आत्मविश्वासाने MHC-I रेणूंच्या प्रथिने परस्परसंवादाचा अभ्यास करण्यावर लक्ष केंद्रित केले.HLA मध्ये α1, α2 आणि α3 डोमेन्स आणि लाइट चेन असतात आणि मायक्रोग्लोब्युलिन β2 (β2m) एक स्थिर शॅपरोन प्रोटीन आहे49.एकदा एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलममध्ये एकत्र झाल्यानंतर, पेप्टाइड लिगँड्स 50 च्या अनुपस्थितीत एचएलए अस्थिर आहे.पेप्टाइड-बाइंडिंग ग्रूव्ह नॉन-पेप्टाइड स्वरूपात अत्यंत पॉलिमॉर्फिक आणि असंरचित α1 आणि α2 डोमेन आणि तुलनेने कमी पॉलिमॉर्फिक α351 डोमेनद्वारे तयार होतो.IFNα च्या उपस्थितीत, आम्हाला दोन HLA-A कॉम्प्लेक्स आढळले: एक HMGA1 आणि H2B (आकृती 5, टेबल S3) शी संवाद साधतो आणि दुसरा MDN1, LRCH4 आणि H2B (आकृती 6) शी संवाद साधतो.
IFNα H2B (H2BFS) आणि HMGA1 सह HLA-A परस्परसंवाद नेटवर्क प्रेरित करते.(A) H2B-HLA-A-HMGA1 कॉम्प्लेक्समधील विविध प्रकारच्या परस्परसंवादाचे चित्रण करणारा 2D प्लॉट (सिम-एक्सएल सॉफ्टवेअरमध्ये तयार केलेला): इंटरलिंक (निळा), इंटरलिंक (लाल) आणि सिंगल लिंक (काळा)..भिन्न ओळखींचे डोमेन कलर कोडेड 32 आहेत: H2B (हिस्टोन; 2-102) आणि MHC-I (MHC_1; 25-203, गट C1; 210-290 आणि MHC_I_C; 337-364).क्रॉस-लिंक थ्रेशोल्ड 3.5 वर सेट केला होता.डॉट प्लॉट H2B (B) आणि HMGA1 (C) सह HLA-A परस्परसंवाद साइट्स तसेच दोन पेप्टाइड्समधील K किंवा S परस्परसंवाद साइट्स दर्शवतात.आकृतीमध्ये, क्रॉस-लिंक स्कोअर थ्रेशोल्ड 3.0 वर सेट केला आहे.(D) PyMOL प्रोग्राममधील H2B, HLA-A आणि HMGA1 प्रथिनांच्या संरचनेत दर्शविलेल्या प्रथिनांमधील संबंध.या संरचना Phyre2 सर्व्हर (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) वापरून तयार केल्या गेल्या आणि H2B, HLA-A आणि HMGA1 प्रथिनांसाठी टेम्पलेट संरचना अनुक्रमे 1kx552, 1kj349 आणि 2eze55 होत्या.
IFNα H2B (H2BFS), MDN1 आणि LRCH4 सह HLA-A परस्परसंवाद नेटवर्कला प्रेरित करते.(A) इंट्रामोलेक्युलर (लाल) आणि इंटरमॉलिक्युलर (निळा) क्रॉसलिंक्स 2D परस्परसंवादी नकाशावर (SIM-XL सॉफ्टवेअरमध्ये व्युत्पन्न केलेले) MDN1 वर्तुळ म्हणून प्रस्तुत केले जातात.क्रॉस-लिंक थ्रेशोल्ड 3.5 वर सेट केला होता.भिन्न ओळखींचे डोमेन कलर कोडेड ३२ आहेत: H2B (हिस्टोन; 2-102), MHC-I (MHC_1; 25-203, गट C1; 210–290 आणि MHC_I_C; 337-364) आणि LRCH4 (LRR_8 (68-126), LRR_8 (137–194) आणि CH (535–641)).(B) PyMOL प्रोग्राममधील H2B, HLA-A, LRCH4 आणि MDN1 प्रथिनांच्या रचनांमध्ये दर्शविलेल्या प्रथिनांमधील संबंध.या संरचना Phyre2 सर्व्हर (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) वापरून H2B, HLA-A, LRCH4 आणि MDN1 प्रथिनांसाठी टेम्पलेट स्ट्रक्चर्स 1kx552, 1kj349, 6hlu62 आणि 6i2665 सह मॉडेल केल्या गेल्या. अनुक्रमेH2B (C), LRCH4 (D), आणि MDN1 (E) सह HLA-A साठी K किंवा S परस्परसंवाद साइट दर्शवणारे डॉट प्लॉट.भूखंडांसाठी, क्रॉस-लिंक स्कोअर थ्रेशोल्ड 3.0 वर सेट केला होता.
जीनोमची अखंडता राखण्याव्यतिरिक्त, हिस्टोन H2B लिप्यंतरणाच्या नियमनात देखील सामील आहे.H2B प्रथिनेमध्ये मध्यवर्ती हिस्टोन डोमेन (HFD) लूपद्वारे विभक्त केलेल्या तीन α-हेलिसेस आणि C-टर्मिनल टेल 41,52 द्वारे तयार केलेले असते.H2B सह बहुतेक संवाद α1 हेलिक्समध्ये होतो, जे HFD हेटरोडाइमर (Fig. 5A,B) सह ट्रायमरायझेशन प्रदान करते.जरी लायसिन डीएनए बंधनात गुंतलेले असले तरी, काही लिसिन वैकल्पिक ऍसिटिलेशन किंवा मेथिलेशन साइट देखील आहेत.उदाहरणार्थ, H2B मधील अवशेष K43, K46, आणि K57 थेट DNA बंधनात गुंतलेले नाहीत, परंतु विविध पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनल बदलांचे लक्ष्य आहेत.त्याचप्रमाणे, H2B मधील अवशेष K44, K47, आणि K57 IFNα च्या उपस्थितीत पर्यायी भूमिका बजावू शकतात, ज्यामध्ये इतर प्रथिने (Fig. 5A, B).याव्यतिरिक्त, एक्स्ट्राक्रोमोसोमल हिस्टोन H2B विविध पेशी प्रकारांमध्ये रोगप्रतिकारक प्रतिक्रिया सक्रिय करते, संक्रामक एजंट्स किंवा खराब झालेल्या पेशींपासून प्राप्त झालेल्या दुहेरी-असरलेल्या DNA (dsDNA) तुकड्यांना शोधण्यासाठी सायटोसोलिक सेन्सर म्हणून कार्य करते.DNA व्हायरसच्या उपस्थितीत, H2B कमी झाल्यामुळे IFN-β उत्पादन आणि STAT154 फॉस्फोरिलेशन प्रतिबंधित होते.H2B इतर कोर हिस्टोन्सपेक्षा अधिक वेगाने न्यूक्लियसमध्ये आणि बाहेर जाण्यासाठी देखील ओळखले जाते.निवडलेल्या उपचार न केलेल्या नमुन्यांमध्ये MDN1 आणि LRCH4 सह H2B परस्परसंवाद देखील आढळून आला.आम्हाला आढळले की HLA-A ने सर्व तीन IFNα-उपचार केलेल्या नमुन्यांमध्ये आणि उपचार न केलेल्या पुनरावृत्ती नमुन्यात H2B शी संवाद साधला.हे डेटा ट्रान्सक्रिप्शनल नियमनापासून स्वतंत्र वैकल्पिक शारीरिक कार्यामध्ये H2B ची भूमिका प्रतिबिंबित करतात.
HMGA1 (उच्च गतिशीलता गट AT-Hook 1), एक लहान न्यूक्लियोप्रोटीन जो रोगाला प्रोत्साहन देणारे अमीनो ऍसिडमध्ये समृद्ध आहे, HLA-A च्या सहयोगाने ओळखले गेले आहे.त्यात अम्लीय सी-टर्मिनल शेपूट आणि तीन वेगळे डीबीडी आहेत ज्यांना AT हुक म्हणतात कारण ते dsDNA55,56 मधील AT-समृद्ध प्रदेशाच्या किरकोळ खोबणीला बांधतात.या बंधनामुळे डीएनए वाकतो किंवा सरळ होतो, कॅनोनिकल ट्रान्सक्रिप्शन घटकांना त्याच्या एकमत अनुक्रमात प्रवेश करण्याची परवानगी मिळते.सी-टर्मिनल पूंछ प्रथिने-प्रोटीन परस्परसंवाद आणि ट्रान्सक्रिप्शन घटकांच्या भरतीमध्ये गुंतलेले असल्याचे मानले जाते, कारण सी-टर्मिनल डिलीशन म्युटंट ट्रान्सक्रिप्शन 57 सुरू करण्यास अक्षम आहेत.शिवाय, या डोमेनमध्ये अनेक संरक्षित फॉस्फोरिलेशन साइट्स आहेत ज्या किनासेस 58 साठी ज्ञात सब्सट्रेट्स आहेत.आम्ही C-टर्मिनल डोमेनच्या बाहेर HMGA1 सह HLA-A आणि H2B परस्परसंवादाचे निरीक्षण केले, जे सूचित करते की C-टर्मिनल डोमेन मुख्यतः ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर बंधनासाठी वापरले जाते (चित्र 5A, C).एचएमजीए प्रथिने अॅडॉप्टर डीएनएला बांधण्यासाठी हिस्टोन एच1 शी स्पर्धा करतात, ज्यामुळे प्रवेशक्षमता वाढते57.त्याचप्रमाणे, असे दिसते की HMGA हिस्टोन H2B सह हिस्टोन H1 च्या स्पर्धेत लिंकर DNA सोबत संवाद साधते.HMGB1 हे डेन्ड्रिटिक पेशींमध्ये HLA-A, -B, आणि -C ची अभिव्यक्ती प्रेरित करते, ज्यामुळे त्यांचे सक्रियकरण होते59, परंतु HMG आणि HLA मधील परस्परसंवाद यापूर्वी नोंदवलेला नाही.आम्हाला आढळले की HMGA1 HLA-A च्या α1 आणि α3 डोमेनशी संवाद साधते, बहुतेक परस्परसंवाद त्याच्या 3 DBD (आकृती 5A,C) च्या बाहेर आहेत.आमच्या हातात, HLA-A हे केंद्रकामध्ये स्थानिकीकृत असल्याचे आढळून आले (डेटा दर्शविला नाही), आणि H2B आणि HMGA1 देखील न्यूक्लियसमध्ये उपस्थित आहेत हे लक्षात घेता, हा परस्परसंवाद न्यूक्लियसमध्ये होण्याची शक्यता आहे.H2B, HLA-A आणि HMGA1 दरम्यान मोजलेले विशिष्ट व्यसन आकृती 5D मध्ये दर्शविले आहे.
HLA-A चे इतर प्रथिनांसह बहुतेक परस्परसंवाद त्याच्या α1 आणि α2 डोमेन आणि अव्यवस्थित सी-टर्मिनल डोमेन (चित्र 6) मध्ये होतात.यापैकी एका उदाहरणामध्ये, आम्हाला आढळले की HLA-A LRCH4 (आकृती 6A,D) च्या विस्कळीत N-टर्मिनल शेपटाशी संवाद साधतो.LRCH4 TLR4 सक्रियकरण आणि LPS साइटोकाइन इंडक्शनचे नियमन करते, ज्यामुळे जन्मजात रोगप्रतिकारक प्रतिसाद60,61 सुधारतो.हे नऊ ल्युसीन-रिच रिपीट्स (LRRs) आणि त्याच्या एक्टोडोमेनमध्ये कॅल्मोड्युलिन (CH) होमोलॉजी मोटिफसह एक झिल्ली प्रोटीन आहे, त्यानंतर ट्रान्समेम्ब्रेन डोमेन (TMD) 60, 62 आहे.प्रथिने-प्रोटीन परस्परसंवाद 60 मध्ये मध्यस्थी करण्यासाठी सीएच डोमेन्सचा अहवाल देण्यात आला आहे.LRR आणि CH डोमेन दरम्यान सुमारे 300 एमिनो ऍसिडचा विस्तार तुलनेने प्रवेशयोग्य आहे परंतु अव्यवस्थित आहे.प्रथिने-प्रोटीन नेटवर्क आणि वेसिक्युलर ट्रान्सपोर्ट 63 चे मध्यस्थ म्हणून अव्यवस्थित प्रदेशांच्या कार्यावर आधारित, आम्हाला आढळले की बहुतेक प्रथिने परस्परसंवाद अव्यवस्थित प्रदेशांमध्ये होतात.MDN1 सह परस्परसंवाद LRR1, LRR6, CH डोमेन्स आणि यादृच्छिक प्रदेशांसह प्रथिनांच्या संपूर्ण लांबीमध्ये वितरीत केले गेले, तर H2B मुख्यत्वे CH डोमेन (Fig. 6A, B) शी बांधील आहे.विशेष म्हणजे, कोणत्याही परस्परसंवादामध्ये TMJ समाविष्ट नाही, जे CLMS दृष्टिकोनाची विशिष्टता सूचित करते (आकृती 6A, B).
MDN1 देखील HLA-A प्रोटीन नेटवर्कचा भाग म्हणून ओळखले गेले आहे (आकृती 6A).हे प्रथिनांच्या AAA कुटुंबाशी संबंधित आहे (विविध क्रियाकलापांशी संबंधित एटीपीस).हे समान N-टर्मिनल AAA डोमेन आहे जे हेक्सामेरिक रिंगमध्ये व्यवस्थित होते आणि 60S 64 राइबोसोमल सब्यूनिटमधून असेंबली घटक काढून टाकते.dynein64,65,66 सारखे दिसते.याव्यतिरिक्त, एएसपी/ग्लू समृद्ध प्रदेश MIDAS डोमेन (मेटल आयन अवलंबित साइट) नंतर येतो.MDN1 (अंदाजे 5600 अमीनो ऍसिड) च्या मोठ्या आकारामुळे आणि चांगल्या-अभ्यास केलेल्या प्रथिनांसह मर्यादित समरूपता यामुळे, मानवांमध्ये त्याची रचना आणि कार्य याबद्दल फारसे माहिती नाही.आम्ही HLA-A, H2B, आणि LRCH4 MDN1 बंधनकारक भागीदार म्हणून ओळखले आणि PyMol (Fig. 6A,B) मध्ये प्रोटीन कॉम्प्लेक्स म्हणून त्यांचे अभिमुखता प्रकट केले.ही तीन प्रथिने एएए डोमेन, डायनिन सारखी लिंकर डोमेन आणि शक्यतो MIDAS MDN1 डोमेनशी संवाद साधतात.मागील अहवालात, आमिष प्रथिनांच्या आत्मीयता शुद्धीकरणाने MDN1 हे हिस्टोन H2B67 शी संबंधित प्रोटीन म्हणून ओळखले.या व्यतिरिक्त, अलीकडील अभ्यासात MDN आणि HLA-B यांच्यातील HCT116 पेशींमधील परस्परसंवादाचा देखील अहवाल दिला गेला आहे, जो आमच्या निष्कर्षांना समर्थन देत, आत्मीयता-शुद्ध मास स्पेक्ट्रोमेट्री वापरून ६८.IFNα-उपचार केलेल्या नमुन्यांमधील या कॉम्प्लेक्सची ओळख इंटरफेरॉन सिग्नलिंगमध्ये MDN1 ची भूमिका सूचित करते.
HLA जनुक अत्यंत बहुरूपी असल्यामुळे, आम्ही Flo-1 पेशींच्या RNA अनुक्रम डेटामधून HLA-A, -B, आणि -C मॅपिंग अनुक्रम वाचन काढले (डेटा दर्शविला नाही).अनुक्रम वाचनाशी सुसंगत असलेल्या पेप्टाइड अनुक्रमांनी HLA-A (आकृती S3) मध्ये क्रॉस-लिंक केलेले पेप्टाइड्स असलेल्या प्रदेशांमध्ये HLA-A, -B, आणि -C मधील लक्षणीय फरक दिसून आला.याव्यतिरिक्त, आम्ही H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 प्रोटीनसह HLA-B/C रेणूंचे प्रोटीन-टू-प्रोटीन क्रॉस-लिंकिंगचे निरीक्षण केले नाही.हे सूचित करते की HLA-A, MDN1, LRCH1 आणि HMGA1 मधील प्रोटीन परस्परसंवाद HLA-A विशिष्ट आहे.याव्यतिरिक्त, नॉन-क्रॉसलिंक नमुन्यांचे प्रोटीओमिक विश्लेषण (टेबल S4) दर्शविते की HLA-A मध्ये HLA-B किंवा HLA-C च्या तुलनेत उच्च अनुक्रम कव्हरेज आहे.एचएलए-ए साठी ओळखले जाणारे पेप्टाइड्स IFNα-उपचार केलेले आणि उपचार न केलेल्या दोन्ही नमुन्यांमध्ये तीव्रतेने जास्त होते.
येथे ओळखले जाणारे परस्परसंवाद जवळच्या अवकाशीय समीपतेमध्ये दोन प्रथिनांच्या गैर-विशिष्ट क्रॉस-लिंकिंगमुळे नाहीत याची खात्री करण्यासाठी, आम्ही सह-इम्युनोप्रीसिपीटेशन असेस करून दोन नवीन एचएलए-ए परस्परसंवादी घटकांची पुष्टी केली.अंतर्जात MDN1 आणि H2B सह HLA-A परस्परसंवाद IFNα-उपचार केलेल्या आणि उपचार न केलेल्या Flo-1 पेशींमध्ये आढळून आले (आकृती 7, आकृती S4).आम्ही पुष्टी केली की H2B द्वारे HLA-A इम्युनोप्रीसीपीटेट्समध्ये कॅप्चर केले गेले होते आणि हे संबंध IFNα उपचारांमुळे होते कारण HLA-A उपचार न केलेल्या पेशींमधून इम्युनोप्रेसिपिटेट नमुन्यांमध्ये अनुपस्थित होता (आकृती 7A).तथापि, आमचा डेटा सूचित करतो की IFNα H2B आणि MDN1 ला HLA-A बंधनकारकपणे विभेदितपणे नियंत्रित करते.IFNα H2B आणि HLA-A मधील संबंध प्रवृत्त करते, परंतु MDN1 सह त्याचा संबंध कमी करते.आम्हाला आढळले की MDN1 हे नियंत्रणांमध्ये HLA-A शी संबंधित होते आणि IFNα जोडल्याने IFNα (आकृती 7B,C) द्वारे MDN1 इंडक्शनपासून स्वतंत्र हा परस्परसंवाद कमी झाला.याव्यतिरिक्त, एचएलए-ए इम्युनोप्रेसिपिटेशनने A549 पेशींमध्ये H2B कॅप्चर केले (चित्र S4), हे सूचित करते की हा संवाद सेल प्रकारापेक्षा स्वतंत्र आहे.एकत्रितपणे, हे परिणाम H2B आणि MDN1 सह HLA-A च्या इंटरफेरॉन-मध्यस्थ परस्परसंवादांना समर्थन देतात.
HLA-A H2B आणि MDN1 सह शुद्ध करते.प्रतिनिधी अंतर्जात H2B (A) आणि MDN1 (B) इम्युनोब्लॉट्सना IFNα-उपचार केलेल्या Flo-1 पेशींमधून इम्युनोप्रीसिपिटेट केले गेले आणि सूचित प्रतिपिंडांची तपासणी केली गेली.उंदीर आणि ससा IgG नकारात्मक नियंत्रण म्हणून वापरले होते.(C) वेगवेगळ्या प्रतिजनांचे सापेक्ष प्रमाण (इनपुट) सूचित प्रतिपिंडांच्या विरूद्ध तपासलेल्या इम्युनोब्लॉट्सद्वारे चित्रित केले जाते, β-actin लोडिंग नियंत्रण म्हणून वापरले गेले.
इंटरफेरॉन-प्रेरित अत्यंत विश्वासार्ह क्रॉस-लिंक्ड नेटवर्क, H2B-HLA-A-HMGA1 च्या संरचनात्मक गुणधर्मांची तपासणी करण्यात आली.आम्ही या कॉम्प्लेक्समध्ये समाविष्ट असलेल्या प्रथिनांची रचनात्मक गतिशीलता समजून घेण्यासाठी पर्यायी दृष्टिकोन म्हणून आण्विक गतिशीलता मॉडेलिंगचा वापर केला (आकृती 8).CLMS डेटामधील निष्कर्ष H2B, HLA-A, आणि HMGA1 प्रथिनांच्या भिन्न स्वरूपाची शक्यता सूचित करतात.म्हणून, खालील संभाव्य कॉम्प्लेक्स सॉल्व्हेंट माध्यमात तयार केले गेले: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, आणि H2B-HLA-A-HMGA1.MOE (मॉलेक्युलर ऑपरेटिंग एन्व्हायर्नमेंट; केमिकल कम्प्युटिंग ग्रुप इंक., मॉन्ट्रियल, क्यूबेक, कॅनडा) पॅकेजचा वापर करून प्रारंभिक प्रोटीन-प्रोटीन डॉकिंग स्क्रीनने या प्रथिनांमध्ये भिन्न असलेली संभाव्य रचना सुचवली (चित्र 8A).डॉकिंग प्रोटीन कॉम्प्लेक्सच्या व्हिज्युअलायझेशनने अनेक परस्परसंवाद आणि संभाव्य रचना प्रकट केल्या (आकृती 5A, 8).अशाप्रकारे, एक संभाव्य रचना आकृती 8A मध्ये (लेबल केलेल्या क्रॉस-लिंकसह) दर्शविली आहे आणि MD मॉडेलिंग पाइपलाइन वापरून त्याचे आणखी मूल्यमापन केले गेले.याव्यतिरिक्त, H2B किंवा HMGA1 चे HLA-A ला बंधनकारक HLA-A (Fig. 8A) साठी H2B ची उच्च आत्मीयता हायलाइट करते.
H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A, आणि H2B-HLA-A-HMGA1 कॉम्प्लेक्समधील संभाव्य नेटवर्क्सची संरचनात्मक गतिशीलता.(A) डावा पॅनल हा इंट्रामोलेक्युलर (लाल) आणि इंटरमॉलिक्युलर (निळा) क्रॉसलिंकचा (क्रॉसलिंक कटऑफ 3.5 वर सेट केलेला) 2D नकाशा (सिम-एक्सएल सॉफ्टवेअरमध्ये तयार केलेला) आहे.याव्यतिरिक्त, ओळखले जाणारे क्रॉस-लिंकिंग अवशेष H2B, HLA-A आणि HMGA1 प्रथिनांच्या संरचनेवर लेबल केलेले आहेत.MOE पॅकेजमध्ये लागू केलेल्या डॉकिंग पाइपलाइनचा वापर करून या प्रथिनांची संबंधित रचना काढण्यात आली.खालच्या डाव्या पॅनेलमध्ये H2B-HLA-A आणि HMGA1-HLA-A कॉम्प्लेक्सची विविध प्रथिने-प्रोटीन बंधनकारकता (GBVI/WSA dG; kcal/mol) असलेली विविध संभाव्य रूपरेषा दर्शविते.(ब) प्रत्येक प्रथिन संरचनेसाठी अणू स्थानांचे (हायड्रोजन अणू वगळून) मानक विचलन (RMSD).(C) आंतरआण्विक प्रथिने-प्रोटीन हायड्रोजन बॉण्ड परस्परसंवाद विविध सिम्युलेटेड कॉम्प्लेक्समधील विशिष्ट परस्पर क्रिया ≥ 10 ns कालावधीचा विचार करून.एच-बॉन्ड दाता-स्वीकारणारा कटऑफ अंतर 3.5 Å वर सेट केला होता आणि दाता-एच-स्वीकारणारा कटऑफ कोन ≥ 160°–180° वर सेट केला होता.(D) लेबल केलेले अवशेष जे HLA-A प्रोटीन-प्रोटीन परस्परसंवाद तयार करतात त्यांच्या संबंधित भागीदारांसह, ≥ 20 ns पसरलेले, डमी HLA-A-H2B आणि HLA-A-HMGA1 कॉम्प्लेक्समधून काढलेले.प्रथिने संरचना 100 ns MDS ची सरासरी रचना दर्शवतात.(ई) HLA-A-H2B आणि HLA-A-HMGA1 कॉम्प्लेक्समधील परस्परसंवाद दोन पेप्टाइड्समधील K किंवा S परस्परसंवाद साइटवर आधारित 100 ns पेक्षा जास्त H2B-HLA सिम्युलेशनद्वारे ट्रॅक केलेल्या परस्परसंवादांच्या तुलनेत.कॉम्प्लेक्स /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.क्रॉस-लिंकच्या मूल्यमापनासाठी थ्रेशोल्ड मूल्य 3.0 वर सेट केले गेले आणि MDS कडून ≥ 10 ns घेतलेल्या विशिष्ट परस्परसंवाद विचारात घेतले गेले.BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) आणि Molecular Operating Environment (MOE; केमिकल कम्प्युटिंग ग्रुप इंक., मॉन्ट्रियल, क्यूबेक, कॅनडा) पॅकेजेस वापरून प्रथिने संरचनांची कल्पना करण्यात आली.
कालांतराने HLA-A रेणूंची स्थिरता (मानक विचलन; RMSD किंवा मानक विचलन; RMSF) सूचित करते की संकुलांमध्ये H2B किंवा HMGA1 प्रथिनांच्या उपस्थितीने HLA-A (आकृती 8B, आकृती S5) स्थिर केले.HMGA1 प्रोटीन HLA-A च्या B2M साइटला घट्ट बांधून ठेवते, HLA-A-HMGA1 किंवा H2B-HLA-A-HMGA1 कॉम्प्लेक्स (आकृती 8B, आकृती S5) मध्ये HLA-A अमीनो ऍसिडची स्थिरता प्रेरित करते.विशेषतः, HLA अवशेष ~60-90 आणि ~180-210 H2B (FIG. 8B) च्या उपस्थितीत कमी लवचिक असल्याचे आढळले.H2B आणि HMGA1 ने H2B-HLA-A-HMGA1 कॉम्प्लेक्समध्ये HLA-A ला एकट्या H2B किंवा HMGA1 च्या बंधनाच्या तुलनेत HLA-A ला चांगले बंधनकारक दाखवले (आकृती 8C,D; टेबल S5).हायड्रोजन बाँडिंगमध्ये गुंतलेले अवशेष (MD मॉडेल केलेले उच्च व्याप्ती ≥ 10 ns) कॉम्प्लेक्समधील CLMS परस्परसंवाद साइट्स (K किंवा S अवशेष) शी जुळतात, जे सूचित करतात की CLMS द्वारे ओळखले जाणारे परस्परसंवाद अतिशय विश्वासार्ह आहेत.विश्वसनीयता (Fig. 8E ).सीएलएमएस आणि एमडी मॉडेलिंगमध्ये, एचएलए-ए अवशेष सुमारे 190-210 आणि सुमारे 200-220 एमिनो ऍसिड अनुक्रमे H2B आणि HMGA1 बांधण्यासाठी आढळले (FIG. 8E).
प्रथिने-प्रोटीन परस्परसंवाद डायनॅमिक स्ट्रक्चरल नेटवर्क तयार करतात जे विशिष्ट उत्तेजनांना प्रतिसाद म्हणून इंट्रासेल्युलर संप्रेषण मध्यस्थी करतात.कारण अनेक प्रोटिओमिक्स पध्दती प्रथिनांच्या एकूण स्थिर स्थितीतील बदल शोधतात, प्रथिने-प्रोटीन परस्परसंवाद डायनॅमिक्सला बंधनकारक इंटरफेस कॅप्चर करण्यासाठी अतिरिक्त साधनांची आवश्यकता असते आणि CLMS हे असे एक साधन आहे.इंटरफेरॉन सिग्नलिंग सिस्टीम हे एक सायटोकाइन नेटवर्क आहे जे पेशींना पर्यावरणीय रोगजनक आणि आंतरिक पॅथॉलॉजिकल सिग्नलच्या श्रेणीला प्रतिसाद देण्यास अनुमती देते, ज्यामुळे इंटरफेरॉन-इन्ड्युसिबल प्रथिनांच्या उपसमूहांच्या समावेश होतो.इंटरफेरॉन-प्रेरित प्रथिनांच्या पॅनेलमध्ये नवीन प्रोटीन-प्रोटीन परस्परसंवाद ओळखले जाऊ शकतात हे निर्धारित करण्यासाठी आम्ही CLMS लागू केले.इंटरफेरॉन-रिस्पॉन्सिव्ह फ्लो-1 सेल मॉडेलमधील ग्लोबल प्रोटीन क्रॉस-लिंकिंग विश्लेषण प्रोटीन कॉम्प्लेक्स कॅप्चर करण्यासाठी वापरले गेले.नॉन-क्रॉस-लिंक्ड आणि क्रॉस-लिंक्ड पेशींमधून ट्रायप्टिक पेप्टाइड्स काढणे पेप्टाइड मोजणी, मार्ग समृद्धी आणि परिभाषित LFQ तीव्रतेसह पेप्टाइड लांबीचे वितरण करण्यास अनुमती देते.कॅनोनिकल इंटरफेरॉन-इंड्युसिबल प्रोटीन्स सकारात्मक अंतर्गत नियंत्रण म्हणून ओळखले गेले, तर MX1, UP18, OAS3 आणि STAT1 सारख्या कॅनोनिकल इंटरफेरॉन-इंड्युसिबल प्रोटीन्सचे नवीन इंटरमॉलिक्युलर आणि इंट्रामोलेक्युलर क्रॉस-लिंक्ड अॅडक्ट्स आढळून आले.विविध संरचनात्मक वैशिष्ट्ये आणि कार्यात्मक क्षेत्रातील परस्परसंवाद तपासले गेले आहेत.
HLA-A, MDN1 आणि H2B मधील परस्परसंवाद Flo-1 आणि A549 पेशींमध्ये इम्युनोब्लोटिंगद्वारे आढळून आला ज्यांचा IFNα सह उपचार आणि उपचार केला गेला नाही.आमचे परिणाम ठळक करतात की HLA-A H2B सह IFNα-आश्रित पद्धतीने कॉम्प्लेक्स आहे.आमचे कार्य या दोन संकुलांच्या सह-स्थानिकीकरणाच्या पुढील अन्वेषणासाठी एक मनोरंजक मार्ग दर्शवते.सेल-प्रकार-स्वतंत्र इंटरफेरॉन-मध्यस्थ प्रोटीन परस्परसंवाद ओळखण्यासाठी सेल लाइन्सच्या पॅनेलमध्ये CLMS दृष्टीकोन विस्तृत करणे देखील मनोरंजक असेल.शेवटी, आम्ही H2BFS-HLA-A-HMGA1 कॉम्प्लेक्समध्ये समाविष्ट असलेल्या प्रथिनांची रचनात्मक गतिशीलता समजून घेण्यासाठी पर्यायी दृष्टिकोन म्हणून MD मॉडेलिंगचा वापर केला, ज्याने इंट्रामोलेक्युलर आणि इंटरमॉलिक्युलर क्रॉस-टॉकचा मागोवा घेतला.CLMS डेटामधील निष्कर्ष H2BFS, HLA-A, आणि HMGA1 प्रथिनांच्या भिन्न स्वरूपाची शक्यता सूचित करतात.या डॉकिंग प्रोटीन कॉम्प्लेक्समधील संभाव्य भिन्न कॉन्फॉर्मेशन्सने सीएलएमएस डेटासेटमध्ये पाहिल्याप्रमाणे अनेक परस्परसंवाद प्रकट केले.आमच्या पद्धतीचे एक मुख्य सामर्थ्य हे आहे की ते HLA सारख्या अत्यंत बहुरूपी जनुकांच्या परस्परसंवादाची सहज ओळख करण्यास अनुमती देते, म्हणून अभ्यास करणे कठीण असलेल्या HLA हॅप्लोटाइप-विशिष्ट प्रथिनांच्या परस्परसंवादाचा अभ्यास करणे मनोरंजक असेल.एकत्रितपणे, आमचा डेटा दर्शवितो की इंटरफेरॉन-प्रेरित सिग्नलिंग नेटवर्कची आमची समज वाढवण्यासाठी आणि ट्यूमर सूक्ष्म वातावरणातील अधिक जटिल इंटरसेल्युलर प्रणालींचा अभ्यास करण्यासाठी आधार प्रदान करण्यासाठी CLMS चा वापर केला जाऊ शकतो.
Flo-1 पेशी ATCC कडून मिळवल्या गेल्या आणि DMEM (Gibco) मध्ये 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमायसिन (इनव्हिट्रोजन), 10% गर्भाच्या बोवाइन सीरम (Gibco) सह पूरक आणि 37°C आणि 5% CO2 वर संग्रहित केल्या गेल्या.उष्मायन.IFNα14 (एडिनबर्ग प्रथिने उत्पादन सुविधेद्वारे उत्पादित) उपचार करण्यापूर्वी पेशी 70-80% संगमापर्यंत वाढल्या होत्या.इतर सर्व रसायने आणि अभिकर्मक सिग्मा एल्ड्रिचकडून खरेदी केले गेले नाहीत तोपर्यंत.
Flo-1 पेशींचे संवर्धन 6-वेल प्लेट्समध्ये करण्यात आले आणि दुसऱ्या दिवशी पेशींवर 10 ng/ml IFNα14 ने 24 तास ते अंदाजे 80% संगमावर उपचार केले गेले.पेशी PBS ने तीन वेळा धुतल्या गेल्या आणि 0.5 mM च्या अंतिम एकाग्रतेसाठी 37° C वर 5 मिनिटांसाठी PBS मध्ये ताजे तयार DSS (थर्मो फिशर सायंटिफिक) (DMSO मध्ये विरघळलेल्या) सह बांधले गेले.DSS क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया PBS ने बदलली गेली आणि PBS मध्ये 20 mM Tris (pH 8.0) जोडून 37°C वर 15 मिनिटांसाठी अवशिष्ट DSS शमवले गेले.पेशी स्क्रॅप करून गोळा केल्या गेल्या आणि कमी बंधनकारक नळ्या (Axygen) मध्ये गोळा केल्या.
सेल पेलेटला 300 μl युरिया लिसिस बफर (8 एम युरिया, 0.1 एम ट्रिस, पीएच 8.5) 30 मिनिटांसाठी खोलीच्या तपमानावर अधूनमधून थरथरणाऱ्या स्वरूपात टाकण्यात आले.सर्व सेंट्रीफ्यूगेशन चरण 14,000 xg वर 8°C वर केले गेले.10 मिनिटांसाठी लायसेटला सेंट्रीफ्यूज करा आणि सुपरनेटंटला नवीन ट्यूबमध्ये स्थानांतरित करा.उर्वरित स्पष्ट कण दुसऱ्या लिसिस बफरच्या 150 μl (2 एम यूरिया, 2% (डब्ल्यू/व्ही) एसडीएस (सोडियम डोडेसिल सल्फेट)) मध्ये 30 मिनिटे किंवा एकसंध जलीय द्रावण मिळेपर्यंत विरघळले गेले.लाइसेट 20 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज केले गेले आणि मागील चरणात मिळालेल्या लाइसेटमध्ये सुपरनॅटंट मिसळले गेले.मायक्रोप्लेट प्रक्रियेसाठी निर्मात्याच्या सूचनांनुसार मायक्रो बीसीए (थर्मो फिशर सायंटिफिक) वापरून प्रथिने एकाग्रतेचे मूल्यांकन केले गेले.नमुने त्वरीत द्रव नायट्रोजनमध्ये गोठवले गेले आणि -80 डिग्री सेल्सियसवर साठवले गेले.
Wisniewski et al द्वारे वर्णन केल्यानुसार सुमारे 100 μg विरघळणारे क्रॉस-लिंक केलेले प्रोटीन सुधारित फिल्टरेशन नमुना तयारी प्रोटोकॉल (FASP) वापरून प्रक्रिया केली गेली.69 थोडक्यात, प्रथिने 200 μl युरिया बफर (0.1 एम ट्रिसमध्ये 8 एम युरिया, पीएच 8.5), भोवरा आणि अर्धवट जोडलेले आहेत.सर्व सेंट्रीफ्यूगेशन चरण 25°C वर 14,000 xg वर केले गेले.क्रॉस-लिंक्ड प्रोटीन लाइसेटचा पहिला अर्धा भाग अल्ट्रासेल-10 मेम्ब्रेन (मर्क) ने सुसज्ज असलेल्या 10 kDa मायक्रोकॉन सेंट्रीफ्यूगल फिल्टर डिव्हाइसमध्ये हस्तांतरित केला गेला, त्यानंतर 25 मिनिटांसाठी फिल्टरवर सेंट्रीफ्यूगेशन केले गेले.नंतर फिल्टरमध्ये प्रोटीनचा दुसरा अर्धा भाग जोडा आणि त्याच चरणांची पुनरावृत्ती करा.यूरिया बफरमध्ये 100 μl 17 एमएम ट्रिस (2-कार्बोक्झिथिल) फॉस्फिन हायड्रोक्लोराइड (TCEP) जोडून प्रथिने पुनर्प्राप्ती केली गेली.रिकव्हरी थर्मोमिक्सरवर 600 rpm वर 30 मिनिटांसाठी 37°C वर ढवळण्यात आली.या व्यतिरिक्त, स्तंभाला सेंट्रीफ्यूज केले गेले आणि यूरिया बफरमध्ये 100 μl 50 mM iodoacetamide वापरून कमी केलेले क्रॉस-लिंक केलेले प्रथिने अल्कायलेट केले गेले.अंधारात 20 मिनिटे खोलीच्या तपमानावर अल्किलेशन प्रतिक्रिया केली गेली.स्तंभ फिरवा, स्तंभाच्या भिंती 100 μl युरिया बफरने 3 वेळा धुवा आणि नंतर सेंट्रीफ्यूज करा.100 एमएम अमोनियम बायकार्बोनेटचे 100 μl वापरून समान ऑपरेशन 3 वेळा केले गेले.ट्रायपसिनायझेशन करण्यापूर्वी, संकलन ट्यूब नवीनसह बदला.ट्रिप्सिन बफर (प्रोमेगा) मध्ये 50 मिमी अमोनियम बायकार्बोनेट आणि 1 μl ट्रिप्सिन पातळ केलेले पाचन बफर जोडा.ट्रिप्सिन आणि प्रथिनांचे गुणोत्तर सुमारे 1:33 राखले गेले आणि पचन क्रिया 37 डिग्री सेल्सिअस तापमानात आर्द्र चेंबरमध्ये रात्रभर उबवल्या गेल्या.क्रॉसलिंक केलेले पेप्टाइड 25 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे फिल्टरमधून काढून टाकण्यात आले.फिल्टरमध्ये 50 μl 0.5 M NaCl जोडून पेप्टाइड पुनर्प्राप्ती सुधारली गेली, त्यानंतर 25 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूगेशन केले.
C18 मायक्रो स्पिन कॉलम्स (हार्वर्ड उपकरण) चा वापर क्रॉस-लिंक केलेले ट्रायप्टिक पेप्टाइड्स डिसॉल्ट करण्यासाठी बौचल एट अल.70 द्वारे वर्णन केलेल्या प्रोटोकॉलनुसार किरकोळ बदलांसह केला गेला.थोडक्यात, acetonitrile (AcN) (Merck) मध्ये 0.1% फॉर्मिक ऍसिड (FA) चे तीन वॉश आणि 0.1% FA च्या दोन वॉशसह C18 स्पिन कॉलम सक्रिय केले गेले.स्तंभ 15 मिनिटांसाठी 0.1% FA सह हायड्रेटेड होता.स्पिन कॉलममध्ये नमुने लोड करा आणि 0.1% FA ने 3 वेळा धुवा.0.1% FA मध्‍ये 50%, 80% आणि 100% AcN वापरून डिसल्ट केलेले पेप्टाइड्स क्रमशः चरणबद्ध ग्रेडियंटसह काढले गेले.अवशिष्ट द्रव पूर्णपणे गायब होईपर्यंत नमुने स्पीडव्हॅक प्लस कॉन्सन्ट्रेटर (एपेनडॉर्फ) मध्ये वाळवले गेले.एल्युटेड पेप्टाइड्स 2.5% AcN मध्ये 0.08% ट्रायफ्लूरोएसेटिक ऍसिडच्या 100 μl मध्ये विरघळली गेली आणि एका नॅनोड्रॉप 2000 (थर्मो सायंटिफिक) वर एकाग्रता मोजली गेली.प्रति नमुन्यासाठी अंदाजे 1 μg क्रॉसलिंक पेप्टाइड LC-MS/MS प्रणालीमध्ये इंजेक्ट केले गेले.
क्रॉस-लिंक केलेले पेप्टाइड्स ऑर्बिट्रॅप एक्सप्लोरिस 480 मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो सायंटिफिक) शी जोडलेल्या अल्टिमेट 3000 RSLCnano LC प्रणालीवर (थर्मो सायंटिफिक) वेगळे केले गेले.क्रॉस-लिंक केलेले पेप्टाइड्स 300 µm आयडीवर, 5 मिमी लांब µ-प्री-कॉलम C18 कॅप्चर कॉलम C18 PepMap100 सॉर्बेंट आणि 5 µm पेपमॅप सॉर्बेंट (थर्मो सायंटिफिक) सह पॅक केले गेले.2.5% AcN मध्ये विरघळलेले 5 μl/min 0.08% trifluoroacetic acid वर पंप फ्लो सेट लोड करा.2 μm पेपमॅप सॉर्बेंट (थर्मो सायंटिफिक) ने भरलेल्या 75 μm आतील व्यास आणि 150 मिमी लांबीच्या विश्लेषणात्मक फ्यूज्ड सिलिका स्तंभावर क्रॉस-लिंक केलेले पेप्टाइड वेगळे केले गेले.मोबाईल फेज A आणि B मध्ये अनुक्रमे पाण्यात 0.1% FA आणि acetonitrile मध्ये 0.1% FA असते.ग्रेडियंट 2.5% B पासून सुरू होतो आणि 90 मिनिटांत रेखीयरीत्या 40% B पर्यंत वाढतो, नंतर पुढील 2 मिनिटांत 90% B पर्यंत.मोबाईल फेज कंपोझिशन 10 मिनिटांसाठी 90% B वर राखली गेली आणि नंतर 2 मिनिटांमध्ये 2.5% B पर्यंत कमी झाली.पुढील चक्रापूर्वी 8 मिनिटांसाठी स्तंभ 2.5% B वर समतोल करण्यात आला.विश्लेषणात्मक स्तंभातून काढलेले क्रॉस-लिंक केलेले पेप्टाइड्स नॅनोइलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (NSI) स्त्रोतामध्ये आयनीकृत केले गेले आणि एक्सप्लोरिस 480 मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो सायंटिफिक) मध्ये इंजेक्शन दिले गेले.
ऑर्बिट्रॅप एक्सप्लोरिस 480 मास स्पेक्ट्रोमीटर सकारात्मक डेटा सहसंबंध मोडमध्ये ऑपरेट केले जाते.m/z 350 Th ते m/z 2000 Th श्रेणी सेटिंग्जसह 120,000 च्या रिझोल्यूशनवर सेक्शन मोडमध्ये पूर्ण स्कॅन केले गेले.50ms च्या कमाल इनपुट वेळेसह सामान्यीकृत AGC लक्ष्य 300% वर सेट केले गेले.पेप्टाइड्ससाठी मोनोइसोटोपिक पीक डिटेक्शन स्थापित केले गेले आहे.जर खूप कमी पूर्ववर्ती आढळले तर मर्यादा शिथिलता पॅरामीटर सत्य वर सेट केला जातो.प्रिकर्सरची किमान आयनिक ताकद 5.0e3 वर सेट केली गेली आणि प्रयोगांमध्ये +8 पर्यंत प्रिकसर चार्ज स्टेट समाविष्ट करण्यात आली.
डेटा सहसंबंध मोडमधील प्रमुख स्कॅन दरम्यानचा सायकल वेळ 2.5 सेकंदांवर सेट केला होता.पूर्ववर्ती आयनच्या पहिल्या विखंडनानंतर डायनॅमिक वस्तुमान अपवर्जन 20 s वर सेट केले गेले.पूर्ववर्ती अलगाव विंडो 2 व्या वर सेट केली होती.स्थिर टक्कर ऊर्जा मोडसह सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जेचा प्रकार डेटा अवलंबून MS/MS स्कॅनमध्ये निवडला गेला.टक्कर ऊर्जा 30% वर सेट.ऑर्बिट्रॅप रिझोल्यूशन 15,000 आणि AGC लक्ष्य 100% वर सेट केले होते.सानुकूल कमाल इंजेक्शन वेळ 60 मिलीसेकंदांवर सेट केली आहे.
क्रॉस-लिंक केलेल्या नमुन्यांमधील प्रोटीन-प्रोटीन नेटवर्कचा मागोवा घेण्यापूर्वी, आम्ही नमुन्यांमधील शोधण्यायोग्य पेप्टाइड्स/प्रथिने ओळखण्यासाठी MaxQuant पॅकेज (आवृत्ती 1.6.12.0)26,27 वापरून कच्च्या फाइल्सवर प्रक्रिया केली.याव्यतिरिक्त, IFNα सह उपचार केलेल्या आणि उपचार न केलेल्या अनक्रॉसलिंक केलेल्या Flo-1 नमुन्यांवर समान प्रोटीओमिक विश्लेषण केले गेले.अंगभूत शोध इंजिन Andromeda27 वापरून MS/MS डेटा UniProt मानवी डेटाबेस (www.uniprot.org) मध्ये शोधला गेला (12 ऑगस्ट 2020 रोजी अपलोड केला गेला, त्यात 75,093 नोंदी आहेत).एन्झाईमची विशिष्टता आणि डेमिडेशन (एन, क्यू) आणि ऑक्सिडेशन (एम) च्या विविध बदलांशिवाय शोध घेण्यात आला.पूर्ववर्ती वस्तुमान सहिष्णुता 20 ppm आणि उत्पादन आयन 0.02 Da वर सेट केली गेली.प्रारंभिक आणि कमाल वस्तुमान विचलन 10 पीपीएम वर सेट केले गेले.पेप्टाइडचे जास्तीत जास्त वस्तुमान 4600 Da वर सेट केले गेले आणि अनुक्रम समानता 7 आणि 25 अमीनो ऍसिड (aa) दरम्यान सेट केली गेली.पर्सियस प्रोग्राम (आवृत्ती 1.6.10.45) वापरून पुढील सांख्यिकीय विश्लेषण केले गेले.प्रथिने सामग्रीची गणना प्रथिनांच्या वर्णक्रमीय तीव्रतेचे सामान्यीकरण करून (LFQ तीव्रता; लेबल न केलेले परिमाण)27 आणि तीव्रतेची मूल्ये लॉग 2 मध्ये रूपांतरित केली गेली.R (v 4.1.2) मधील फीटमॅप (v1.0.12) पॅकेज वापरून त्यांच्या पेप्टाइड तीव्रतेद्वारे ओळखल्या जाणार्‍या प्रथिनांचे श्रेणीबद्ध क्लस्टरिंग तयार केले गेले.उपचार न केलेल्या नमुन्यांच्या तुलनेत IFNα-उपचार केलेल्या प्रथिनांसाठी रिएक्टोम पाथवे डेटाबेस वापरून पथवे संवर्धन विश्लेषण केले गेले.
LC-MS/MS द्वारे निरीक्षण केलेल्या प्रोटीन कॉम्प्लेक्सच्या लाइसिन (K) किंवा सेरीन (S) विशिष्ट रासायनिक क्रॉसलिंक्सची ओळख क्रॉस-लिंक्ड पेप्टाइड्स (SIM-XL)29 साठी स्पेक्ट्रोस्कोपिक आयडेंटिफिकेशन मशीन (SIM-XL) वापरून केली गेली.प्रथम, इंटरफेरॉन-संबंधित (IFN) DNA डॅमेज रेझिस्टन्स सिग्नेचर (IRDS) जनुकांमधील संभाव्य परस्परसंवादाचा पडारिया et al.28 मध्ये वर्णन केलेल्या IRDS प्रोटीन डेटासेटचा वापर करून तपास करण्यात आला.संपूर्ण मानवी UniProt च्या सर्व परिस्थिती आणि पुनरावृत्ती तपासणे संगणकीयदृष्ट्या गहन आहे, म्हणून संपूर्ण मानवी UniProt डेटाबेस (www.uniprot.org) (12 ऑगस्ट 2020 रोजी डाउनलोड केला, 75,093 नोंदी समाविष्ट आहेत) IFNα-उपचार केलेल्या पुनरावृत्तींविरूद्ध.उच्च विश्वास संवादांसाठी फिल्टरपैकी एक.प्राप्त केलेल्या या उच्च-महत्त्वाच्या परस्परसंवादांचा विस्तार केला गेला आणि सर्व पुनरावृत्ती आणि परिस्थितींमध्ये चाचणी केली गेली.
SIM-XL मध्ये, DSS क्रॉसलिंकर (XL) साठी वापरला गेला आणि XL वेट शिफ्ट आणि बदल वजन शिफ्ट अनुक्रमे 138.06 आणि 156.07 वर सेट केले गेले.खालील क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया साइट्सचा विचार केला जातो: KK, KS आणि KN-TERM, रिपोर्टर आयनशिवाय.प्रिकर्सर आणि फ्रॅगमेंट पीपीएम दोन्ही 20 वर सेट केले होते आणि Xrea थ्रेशोल्ड 0.15 वर सेट केले होते.ट्रिप्सिन पूर्णपणे विशिष्ट मानली गेली आणि उच्च-ऊर्जा सी-ट्रॅप (एचसीडी) विखंडन पद्धत लागू केली गेली.XCorr डायनॅमिक DB कपात थ्रेशोल्ड आणि डायनॅमिक DB कमी करण्यासाठी पेप्टाइड्सची किमान संख्या अनुक्रमे 2.5 आणि 2 वर सेट केली गेली.इतर मापदंड आहेत: मोनोइसोटोप संभाव्यता आणि पीक योगायोग कटऑफ, किमान 4 AA अवशेष प्रति स्ट्रँड आणि जास्तीत जास्त स्ट्रँड चार्ज आणि चुकलेल्या स्प्लिट्सचे 3 कमाल.परिणामी स्टिच केलेल्या 2D नकाशेचे विश्लेषण (SIM-XL) मध्ये केले गेले आणि xQuest28 ग्राफिकल प्रतिनिधित्व 2D नकाशे तयार करण्यासाठी वापरले गेले.प्रोटीन स्ट्रक्चर्सवरील प्रोटीन क्रॉसलिंक्स PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, version 2.0 Schrödinger, LLC) मध्ये प्रदान केले आहेत.
प्रथिने मॉडेल संरचना Phyre2 सर्व्हर (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 वापरून तयार केली गेली होती ज्यामध्ये होमोलॉजी मॉडेलिंग आणि “हिडन मार्कोव्ह मेथड” च्या अंमलबजावणीची तत्त्वे वापरली गेली होती.Phyre2 ज्ञात प्रोटीन स्ट्रक्चर्ससह अनुक्रम संरेखनावर आधारित मॉडेल संरचना निर्माण करते.H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 आणि MDN1 प्रथिनांसाठी, टेम्पलेट संरचना 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 आणि 6i2665 वापरल्या गेल्या.याव्यतिरिक्त, AlphaFold71 MX1, UBP18 आणि ROBO1 ची रचना देखील विचारात घेण्यात आली.BIOVIA डिस्कव्हरी स्टुडिओ व्हिज्युअलायझर पॅकेज (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) आणि मॉलेक्युलर ऑपरेटिंग एन्व्हायर्नमेंट पॅकेज (MOE; केमिकल कॉम्प्युटिंग ग्रुप इंक., मॉन्ट्रियल, क्यूबेक, कॅनडा) वापरून प्रथिने रचना दृश्यमान करण्यात आली.