347 12.7*1.24 मिमी स्टेनलेस स्टील कॉइल केलेले टयूबिंग, सिंक्रोनस इलेक्ट्रोस्टॅटिक कंडेन्सेशनची आण्विक यंत्रणा आणि α-synuclein आणि tau चे एकत्रीकरण

Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद.तुम्ही मर्यादित CSS समर्थनासह ब्राउझर आवृत्ती वापरत आहात.सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये सुसंगतता मोड अक्षम करा).याव्यतिरिक्त, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही शैली आणि JavaScript शिवाय साइट दर्शवतो.
प्रति स्लाइड तीन लेख दर्शवणारे स्लाइडर.स्लाइड्समधून जाण्यासाठी मागील आणि पुढील बटणे वापरा किंवा प्रत्येक स्लाइडमधून जाण्यासाठी शेवटी स्लाइड कंट्रोलर बटणे वापरा.

347 स्टेनलेस स्टील पाईप तपशील

347 12.7*1.24mm स्टेनलेस स्टील कॉइल केलेले ट्यूबिंग

बाहेरील व्यास: 6.00 मिमी OD पर्यंत 914.4 मिमी OD पर्यंत, 24” NB पर्यंत आकार उपलब्ध एक्स-स्टॉक, OD आकाराच्या स्टील ट्यूब्स उपलब्ध एक्स-स्टॉक

SS 347 पाईपची जाडी श्रेणी: 0.3 मिमी - 50 मिमी, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, इ. (0.5-12 मिमी) किंवा आवश्यकतेनुसार तयार करण्यासाठी नॉन-नियमित आकार

प्रकार: SS 347 सीमलेस पाईप्स |SS 347 ERW पाईप्स |SS 347 वेल्डेड पाईप्स |SS 347 फॅब्रिकेटेड पाईप्स |SS 347 CDW ट्यूब, LSAW पाईप्स / सीम-वेल्डेड / पुन्हा काढलेले

फॉर्म: SS 347 राउंड पाईप्स/ ट्यूब्स, SS 347 स्क्वेअर पाईप्स/ ट्यूब्स, SS 347 आयताकृती पाईप/ ट्यूब्स, SS 347 गुंडाळलेल्या नळ्या, SS 347 “U” आकार, SS 347 पॅन केक कॉइल्स, SS 347 Hydras

लांबी: सिंगल यादृच्छिक, दुहेरी यादृच्छिक आणि आवश्यक लांबीचा शेवट: साधा टोक, बेव्हल्ड एंड, ट्रेडेड

एंड प्रोटेक्शन: प्लास्टिक कॅप्स |बाहेरील फिनिश: 2B, No.4, No.1, No.8 स्टेनलेस स्टील पाईप्ससाठी मिरर फिनिश, ग्राहकांच्या गरजेनुसार फिनिश

डिलिव्हरी स्थिती: एनील्ड आणि लोणचे, पॉलिश, ब्राइट एनील्ड, कोल्ड ड्रॉ

तपासणी, चाचणी अहवाल: मिल चाचणी प्रमाणपत्रे, EN 10204 3.1, रासायनिक अहवाल, यांत्रिक अहवाल, PMI चाचणी अहवाल, व्हिज्युअल तपासणी अहवाल, तृतीय पक्ष तपासणी अहवाल, NABL मंजूर प्रयोगशाळा अहवाल, विनाशकारी चाचणी अहवाल, विनाशकारी चाचणी अहवाल

पॅकिंग: लाकडी खोक्यांमध्ये पॅक केलेले, प्लास्टिकच्या पिशव्या, स्टीलच्या पट्ट्या बांधलेल्या किंवा ग्राहकांच्या विनंतीनुसार

विशेष: वरील व्यतिरिक्त आकार आणि तपशील विनंतीनुसार तयार केले जाऊ शकतात

SS 347 पाईप आकार श्रेणी: 1/2 इंच NB, OD ते 24 इंच

ASTM A312 347: उच्च तापमान आणि सामान्य संक्षारक सेवेसाठी अभिप्रेत अखंड आणि सरळ-सीम वेल्डेड ऑस्टेनिटिक पाईप.वेल्डिंग दरम्यान फिलर मेटलला परवानगी नाही.

ASTM A358 347: संक्षारक आणि/किंवा उच्च तापमान सेवेसाठी इलेक्ट्रिक फ्यूजन वेल्डेड ऑस्टेनिटिक पाईप.सामान्यत: या तपशीलासाठी फक्त 8 इंच पर्यंत पाईप तयार केले जातात.वेल्डिंग दरम्यान फिलर मेटल जोडण्याची परवानगी आहे.

ASTM A790 347: सीमलेस आणि स्ट्रेट-सीम वेल्डेड फेरिटिक/ऑस्टेनिटिक (डुप्लेक्स) पाईप सामान्य संक्षारक सेवेसाठी, ताण गंज क्रॅकिंगच्या प्रतिकारावर विशेष जोर देऊन.

ASTM A409 347: स्ट्रेट-सीम किंवा सर्पिल-सीम ​​इलेक्ट्रिक फ्यूजन वेल्डेड मोठ्या व्यासाचा ऑस्टेनिटिक लाइट-वॉल पाईप 14" ते 30" आकारात भिंती Sch5S आणि Sch 10S सह संक्षारक आणि/किंवा उच्च

ASTM A376 347: उच्च तापमान अनुप्रयोगांसाठी सीमलेस ऑस्टेनिटिक पाईप.

ASTM A813 347: उच्च तापमान आणि सामान्य संक्षारक अनुप्रयोगांसाठी सिंगल-सीम, सिंगल- किंवा डबल-वेल्डेड ऑस्टेनिटिक पाईप.

ASTM A814 347: उच्च तापमान आणि सामान्य संक्षारक सेवेसाठी कोल्ड-वर्क केलेले वेल्डेड ऑस्टेनिटिक पाईप.

347H स्टेनलेस स्टील पाईप्सची रासायनिक रचना

स्टेनलेस स्टील 347H पाईप यांत्रिक गुणधर्म

स्टेनलेस स्टील 347H पाईप्स भौतिक गुणधर्म

347H स्टेनलेस स्टील पाईपसाठी समतुल्य ग्रेड

Amyloid alpha-synuclein (αS) एकत्रीकरण हे पार्किन्सन रोग आणि इतर synucleinopathies चे वैशिष्ट्य आहे.अलीकडे, सामान्यतः अल्झायमर रोगाशी संबंधित ताऊ प्रथिने αS पॅथॉलॉजीशी संबंधित आहेत आणि αS-युक्त समावेशांमध्ये सह-स्थानिकीकरण झाल्याचे आढळले आहे, जरी दोन प्रथिने एकत्रीकरणाची आण्विक यंत्रणा अस्पष्ट आहे.आम्ही येथे नोंदवतो की αS टप्पा इलेक्ट्रोस्टॅटिक कॉम्प्लेक्स कंडेन्सेशन द्वारे द्रव कंडेन्सेटमध्ये विभक्त होतो ज्यामध्ये सकारात्मक चार्ज पॉलीपेप्टाइड्स असतात जसे की टाऊ.पॉलीकेशन्ससाठी αS ची आत्मीयता आणि कोग्युलेशन नेटवर्कच्या व्हॅलेन्स कमी होण्याच्या दरावर अवलंबून, गुठळ्या जलद झिलेशन किंवा एकत्रीकरणातून जातात आणि त्यानंतर हळू एमायलोइड एकत्रीकरण होते.प्रगत जैवभौतिक तंत्रांचा संच एकत्रित करून, आम्ही द्रव-द्रव αS/Tau फेज विभक्तीचे वैशिष्ट्यीकृत करू शकलो आणि द्रव प्रथिने कंडेन्सेटमध्ये दोन्ही प्रथिने असलेल्या विषम समुच्चयांच्या निर्मितीस कारणीभूत मुख्य घटक ओळखू शकलो.
मेम्ब्रेन कंपार्टमेंट्स व्यतिरिक्त, पेशींमध्ये अवकाशीय पृथक्करण द्रव-द्रव फेज सेपरेशन (LLPS) म्हणून ओळखल्या जाणार्‍या प्रक्रियेद्वारे बायोमोलेक्युलर कंडेन्सेट किंवा थेंब नावाच्या प्रथिने-समृद्ध, द्रव-सदृश दाट शरीराच्या निर्मितीद्वारे देखील साध्य केले जाऊ शकते.हे थेंब बहुसंयोजक ऐहिक परस्परसंवादाद्वारे तयार होतात, सामान्यत: प्रथिने किंवा प्रथिने आणि आरएनए यांच्यात आणि जवळजवळ सर्व जिवंत प्रणालींमध्ये विविध कार्ये करतात.मोठ्या संख्येने एलएलपी-सक्षम प्रथिने कमी जटिलतेचे अनुक्रम प्रदर्शित करतात जे निसर्गात अत्यंत विस्कळीत असतात आणि बायोमोलेक्युलर कंडेन्सेट्स 3,4,5 तयार करतात.असंख्य प्रायोगिक अभ्यासांनी प्रथिनांचे लवचिक, अनेकदा विस्कळीत आणि बहुसंयोजक स्वरूप उघड केले आहे जे या द्रव-सदृश कंडेन्सेट बनवतात, जरी या घनरूप घटकांची वाढ आणि परिपक्वता नियंत्रित करणार्‍या विशिष्ट आण्विक निर्धारकांबद्दल फारसे माहिती नाही. राज्य.
नवीन डेटा या कल्पनेला समर्थन देतो की प्रथिने-चालित LLPS आणि थेंबांचे घन संरचनांमध्ये रूपांतर हे संबंधित सेल्युलर मार्ग असू शकतात ज्यामुळे अघुलनशील विषारी समुच्चय तयार होतात जे बहुतेक वेळा डीजनरेटिव्ह रोगांचे वैशिष्ट्य असतात.अनेक LLPS-संबंधित इंट्रीन्सली डिसऑर्डर प्रोटीन (IDPs), बहुतेक वेळा जास्त चार्ज केलेले आणि लवचिक असतात, दीर्घकाळापासून अमायलोइड एकत्रीकरणाच्या प्रक्रियेद्वारे न्यूरोडीजनरेशनशी संबंधित आहेत.विशेषतः, FUS7 किंवा TDP-438 सारखे बायोमोलेक्युलर IDP कंडेन्सेट किंवा hnRNPA19 सारख्या मोठ्या कमी जटिलतेचे डोमेन असलेले प्रथिने द्रवीकरण नावाच्या प्रक्रियेद्वारे जेलसारखे किंवा अगदी घन रूपात वृद्ध झाल्याचे दिसून आले आहे.कंपाऊंडसॉलिड फेज ट्रान्झिशन (LSPT) कडे वेळेचे कार्य म्हणून किंवा काही पोस्ट-अनुवादात्मक बदल किंवा पॅथॉलॉजिकलदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण उत्परिवर्तनांच्या प्रतिसादात 1,7.
Vivo मधील LLPS शी संबंधित आणखी एक IDP म्हणजे Tau, एक मायक्रोट्यूब्यूल-संबंधित डिसऑर्डर प्रोटीन ज्याचे amyloid एकत्रीकरण अल्झायमर रोगात गुंतलेले आहे10 परंतु अलीकडे पार्किन्सन रोग (PD) आणि इतर सिनॅप्टिक आण्विक प्रोटीनोपॅथी 11, 12, 13 संबंधित आहेत.अनुकूल इलेक्ट्रोस्टॅटिक आंतरक्रियांमुळे Tau उत्स्फूर्तपणे द्रावण/साइटोप्लाझमपासून विलग झाल्याचे दर्शविले गेले आहे14, परिणामी टाऊ-समृद्ध थेंब तयार होतात ज्यांना इलेक्ट्रोस्टॅटिक कोसर्व्हेट्स म्हणतात.हे देखील निदर्शनास आले आहे की या प्रकारची गैर-विशिष्ट परस्परसंवाद ही निसर्गातील अनेक बायोमोलेक्युलर कंडेन्सेट्समागील प्रेरक शक्ती आहे15.टाऊ प्रोटीनच्या बाबतीत, इलेक्ट्रोस्टॅटिक एकत्रीकरण साध्या एकत्रीकरणाद्वारे तयार केले जाऊ शकते, ज्यामध्ये प्रथिनांचे विरुद्ध चार्ज केलेले क्षेत्र क्लीवेज प्रक्रियेस चालना देतात किंवा RNA सारख्या नकारात्मक चार्ज केलेल्या पॉलिमरसह परस्परसंवादाद्वारे जटिल एकत्रीकरणाद्वारे.
अलीकडे, α-synuclein (αS), PD आणि इतर neurodegenerative रोगांमध्ये समाविष्ट असलेला amyloid IDP जो एकत्रितपणे synucleinopathy17,18 म्हणून ओळखला जातो, सेल्युलर आणि प्राण्यांच्या मॉडेल्समध्ये 19,20 द्रवपदार्थासारख्या वर्तनासह प्रथिने कंडेन्सेटमध्ये केंद्रित आहे.इन विट्रो अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की αS प्रामुख्याने हायड्रोफोबिक परस्परसंवादाद्वारे साध्या एकत्रीकरणाद्वारे LLPS करतो, जरी या प्रक्रियेसाठी अपवादात्मकपणे उच्च प्रथिने सांद्रता आणि विशेषत: दीर्घ उष्मायन वेळा 19,21 आवश्यक असतात.विवोमध्ये आढळून आलेले αS-युक्त कंडेन्सेट या किंवा इतर LLPS प्रक्रियेद्वारे तयार झाले आहेत की नाही हा एक महत्त्वाचा अनसुलझे मुद्दा आहे.त्याचप्रमाणे, PD आणि इतर synucleinopathies मधील न्यूरॉन्समध्ये αS amyloid एकत्रीकरण आढळून आले असले तरी, αS इंट्रासेल्युलर अमायलोइड एकत्रीकरणातून जाणारी नेमकी यंत्रणा अस्पष्ट राहिली आहे, कारण या प्रथिनांच्या अतिप्रमाणात ही प्रक्रिया स्वतःच सुरू होत असल्याचे दिसत नाही.इंट्रासेल्युलर αS एमायलोइड असेंब्लींच्या पुनर्नवीकरणासाठी विशिष्ट सेल्युलर स्थाने किंवा सूक्ष्म वातावरण आवश्यक असल्याचे सुचवून अतिरिक्त सेल्युलर नुकसान अनेकदा आवश्यक असते.एक सेल्युलर वातावरण जे विशेषतः एकत्रीकरणास प्रवण असते ते प्रोटीन कंडेन्सेट 23 चे आतील भाग असू शकते.
विशेष म्हणजे, αS आणि tau हे पार्किन्सन्स रोग आणि इतर सिन्यूक्लिनोपॅथी 24,25 सह मानवांमध्ये वैशिष्ट्यपूर्ण रोगांच्या समावेशामध्ये सह-स्थानिकीकृत असल्याचे आढळले आहे आणि प्रयोगांनी दोन प्रथिने 26,27 दरम्यान एक समन्वयात्मक पॅथॉलॉजिकल संबंध नोंदवले आहेत जे एकत्रीकरण αS आणि दरम्यान संभाव्य संबंध सूचित करतात. neurodegenerative रोग मध्ये tau.आजार.αS आणि tau विट्रो आणि व्हिव्हो 28,29 मध्ये एकमेकांच्या एकत्रीकरणात संवाद साधतात आणि प्रोत्साहन देतात असे आढळले आहे आणि या दोन प्रथिनांनी बनलेले विषम समुच्चय सिन्यूक्लिनोपॅथी 30 असलेल्या रुग्णांच्या मेंदूमध्ये आढळून आले आहेत.तथापि, αS आणि tau यांच्यातील परस्परसंवादाचा आण्विक आधार आणि त्याच्या सह-एकत्रीकरणाच्या यंत्रणेबद्दल फारसे माहिती नाही.αS चे अत्यंत नकारात्मक चार्ज असलेले C-टर्मिनल क्षेत्र आणि टाऊचे मध्य प्रोलाइन-समृद्ध प्रदेश यांच्यातील इलेक्ट्रोस्टॅटिक आकर्षणाद्वारे ताऊशी संवाद साधल्याचे नोंदवले गेले आहे, जे सकारात्मक चार्ज केलेल्या अवशेषांमध्ये देखील समृद्ध आहे.
या अभ्यासात, आम्ही दर्शवितो की पॉली-एल-लाइसिन (पीएलके) सारख्या इतर सकारात्मक चार्ज केलेल्या पॉलीपेप्टाइड्सच्या परस्परसंवादाच्या विपरीत, टॉ प्रोटीनच्या उपस्थितीत इलेक्ट्रोस्टॅटिक कॉम्प्लेक्स कंडेन्सेशनद्वारे αS खरंच थेंबांमध्ये विलग होऊ शकतो आणि या प्रक्रियेत.αS ड्रॉपलेट नेटवर्कसाठी स्कॅफोल्ड रेणू म्हणून कार्य करते.आम्ही इलेक्ट्रोस्टॅटिक αS coacervates च्या परिपक्वता प्रक्रियेत लक्षणीय फरक ओळखले आहेत, जे coacervate नेटवर्कमध्ये समाविष्ट असलेल्या प्रथिनांच्या परस्परसंवादाच्या व्हॅलेन्सी आणि सामर्थ्यामधील फरकांशी संबंधित आहेत.विशेष म्हणजे, आम्ही दीर्घकालीन द्रव कोसरवेट्समध्ये αS आणि tau amyloid प्रथिनांचे सह-एकत्रीकरण पाहिले आणि काही प्रमुख घटक ओळखले ज्यामुळे अशा कोसरवेट्समध्ये या दोन प्रथिनांचे सह-एकत्रीकरण होते.येथे आम्ही या प्रक्रियेचे तपशीलवार वर्णन करतो, जी रोग-विशिष्ट समावेशांमध्ये दोन प्रथिनांचे एकत्रीकरण अंतर्निहित संभाव्य आण्विक यंत्रणा आहे.
αS कडे तटस्थ pH (Fig. 1a) वर उच्च anionic C-टर्मिनल शेपूट आहे, आणि आम्ही असे गृहित धरले की ते पॉलीकेशनिक डिसऑर्डर पॉलीपेप्टाइड रेणू असलेल्या इलेक्ट्रोस्टॅटिक कॉम्प्लेक्सच्या संक्षेपणातून LLPS होऊ शकते.आम्ही 100-रेसिड्यू पॉली-एल-लाइसिन (pLK) हे न्यूट्रल pH 32 वर पॉझिटिव्ह चार्ज्ड आणि डिसऑर्डर पॉलिमरिक प्रकृतीमुळे प्रारंभिक मॉडेल रेणू म्हणून वापरले. प्रथम, आम्ही पुष्टी केली की pLK सोल्यूशन NMR स्पेक्ट्रोस्कोपीद्वारे αS च्या Ct डोमेनशी संवाद साधतो. (आकृती 1b) 13C/15N-लेबलयुक्त αS वापरून αS:pLK दाढ गुणोत्तर वाढवण्याच्या उपस्थितीत.αS च्या Ct-डोमेनसह pLK चा परस्परसंवाद रासायनिक बदलाच्या गोंधळात आणि प्रथिनांच्या या प्रदेशातील शिखर तीव्रतेत घट झाल्यामुळे प्रकट होतो.विशेष म्हणजे, जेव्हा आम्ही pLK सह αS मिसळतो तेव्हा साधारण αS एकाग्रतेवर.पॉलिथिलीन ग्लायकोल (5–15% PEG-8) च्या उपस्थितीत 5–25 µM (नमुनेदार LLPS बफर: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) आम्ही लगेच प्रथिने निर्मितीच्या विस्तृत क्षेत्रातून गेलो. .फ्लूरोसेन्स (WF) आणि ब्राइट-फील्ड (BF) मायक्रोस्कोपी (Fig. 1c) वापरून थेंबांचे निरीक्षण केले गेले.1-5 µm थेंब ज्यामध्ये केंद्रित αS (जोडले 1 µM AlexaFluor488-लेबल केलेले αS, AF488-αS), त्यांचे इलेक्ट्रोस्टॅटिक गुणधर्म त्यांच्या 10% 1,6-हेक्सेनेडिओल (1,6-HD) च्या प्रतिरोधकतेवरून आणि त्याच्या संवेदनक्षमतेवरून मिळू शकतात. NaCl एकाग्रतेत वाढ (Fig. 1c).αS/pLK इलेक्ट्रोस्टॅटिक कॉम्प्लेक्सच्या कोसरवेट्सचे द्रवासारखे स्वरूप त्यांच्या मिलिसेकंदांमध्ये (चित्र 1d) फ्यूज करण्याच्या क्षमतेद्वारे प्रदर्शित केले जाते.टर्बिडिमेट्री वापरून, आम्ही या परिस्थितीत थेंबांच्या निर्मितीचे प्रमाण निश्चित केले, त्याच्या स्थिरतेशी संबंधित मुख्य परस्परसंवादाच्या इलेक्ट्रोस्टॅटिक स्वरूपाची पुष्टी केली (चित्र 1e), आणि LLPS प्रक्रियेवरील विविध पॉलिमर गुणोत्तरांच्या प्रभावाचे मूल्यांकन केले (चित्र 1f).जरी पॉलीमर गुणोत्तरांच्या विस्तृत श्रेणीवर थेंबाची निर्मिती दिसून येते, परंतु जेव्हा pLK αS पेक्षा जास्त असते तेव्हा प्रक्रिया अतिशय अनुकूल असते.एलएलपी देखील रासायनिकदृष्ट्या भिन्न विस्थापन एजंट डेक्सट्रान-70 (70 kDa) वापरून किंवा ग्लास स्लाइड ड्रॉप्स, विविध सामग्रीच्या मायक्रोप्लेट विहिरी, एपेनडॉर्फ किंवा क्वार्ट्ज केशिका यासह विविध नमुना स्वरूप वापरताना आढळून आले आहेत.
या अभ्यासात वापरल्या जाणार्‍या WT-αS आणि ΔCt-αS प्रकारांमधील विविध प्रथिने क्षेत्रांचे योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व.एम्फिपॅथिक एन-टर्मिनल डोमेन, हायड्रोफोबिक अमायलोइड-फॉर्मिंग (एनएसी) क्षेत्र आणि नकारात्मक चार्ज केलेले सी-टर्मिनल डोमेन अनुक्रमे निळ्या, नारंगी आणि लाल रंगात दर्शविले आहेत.WT-αS चा निव्वळ शुल्क प्रति अवशिष्ट (NCPR) नकाशा दर्शविला आहे.b macromolecular clumps च्या अनुपस्थितीत αS/pLK परस्परसंवादाचे NMR विश्लेषण.pLK एकाग्रता वाढते (αS:pLK दाढ गुणोत्तर 1:0.5, 1:1.5 आणि 1:10 अनुक्रमे हलका हिरवा, हिरवा आणि गडद हिरव्या रंगात दर्शविला जातो).c Coacervate αS/pLK (मोलर रेशो 1:10) 25 µM (1 µM AF488-लेबल केलेले αS किंवा WF इमेजिंगसाठी Atto647N-लेबल केलेले pLK) LLPS बफरमध्ये (टॉप) किंवा 500 mMtobot सह पूरक किंवा डावीकडे % 1,6-हेक्सानेडिओल (1,6-HD; तळाशी उजवीकडे).स्केल बार = 20 µm.d 25 μM च्या एकाग्रतेवर αS/pLK (मोलर रेशो 1:10) च्या BF ड्रॉपलेट फ्यूजनच्या प्रतिनिधी सूक्ष्म प्रतिमा;बाण वैयक्तिक थेंब (लाल आणि पिवळे बाण) 200 ms च्या आत नवीन ड्रॉप (नारिंगी बाण) मध्ये विलीन झाल्याचे सूचित करतात).स्केल बार = 20 µm.25 µM αS वर 500 mM NaCl किंवा 10% 1,6-HD जोडण्यापूर्वी आणि नंतर LLPS बफरमध्ये लाइट स्कॅटरिंग (350 nm वर) αS/pLK एकत्रीकरण (N = 3 नमुना प्रतिकृती, सरासरी आणि मानक विचलन देखील सूचित केले आहे).f BF प्रतिमा (शीर्ष) आणि 25 μM αS वर αS/pLK एकत्रीकरणाचे प्रकाश विखुरणारे विश्लेषण (350 nm, तळाशी) वाढत्या αS:pLK मोलर रेशोसह (N = 3 नमुना प्रतिकृती, सरासरी आणि मानक विचलन देखील सूचित केले आहे).स्केल बार = 10 µm.एका प्रतिमेवरील स्केल बार एका पॅनेलमधील सर्व प्रतिमांचे प्रमाण दर्शवते.कच्चा डेटा रॉ डेटा फाइल्सच्या स्वरूपात प्रदान केला जातो.
αS/pLK इलेक्ट्रोस्टॅटिक कॉम्प्लेक्स कंडेन्सेशन आणि tau31 सह थेट परस्परसंवादाद्वारे tau/RNA कंडेन्सेटचा क्लायंट रेणू म्हणून αS च्या मागील निरीक्षणांच्या आधारावर, आम्ही असे गृहित धरले की αS आणि tau RNA च्या अनुपस्थितीत सॉल्व्हेंटसह सह-विभक्त होऊ शकतात. संक्षेपणइलेक्ट्रोस्टॅटिक कॉम्प्लेक्सद्वारे, आणि αS हे αS/Tau coacervates मधील स्कॅफोल्ड प्रोटीन आहे (आकृती 2e मध्ये टाऊ चार्ज वितरण पहा).LLPS बफरमध्ये जेव्हा 10 μM αS आणि 10 μM Tau441 (अनुक्रमे 1 μM AF488-αS आणि 1 μM Atto647N-Tau असलेले) एकत्र मिसळले गेले तेव्हा त्यांनी सहजपणे दोन्ही प्रथिने असलेले प्रोटीन समुच्चय तयार केले, जसे WF मायक्रोस्कोपीने पाहिले.(Fig. 2a).थेंबांमधील दोन प्रथिनांचे एकत्रीकरण कॉन्फोकल (CF) मायक्रोस्कोपी (पूरक अंजीर 1a) द्वारे पुष्टी होते.जेव्हा dextran-70 एकत्रीकरण एजंट (पूरक अंजीर 1c) म्हणून वापरले गेले तेव्हा तत्सम वर्तन दिसून आले.एकतर FITC-लेबल केलेले PEG किंवा dextran वापरून, आम्हाला आढळले की दोन्ही क्राउडिंग एजंट नमुन्यांमध्ये समान रीतीने वितरीत केले गेले होते, जे वेगळेपणा किंवा असोसिएशन दर्शवत नाहीत (पूरक चित्र 1d).उलट, हे सूचित करते की या प्रणालीमध्ये ते मॅक्रोमोलेक्युलर क्राउडिंग इफेक्ट्सद्वारे फेज विभक्त होण्यास प्रोत्साहन देतात, कारण PEG हे प्राधान्याने स्थिर क्राउडिंग एजंट आहे, जसे की इतर एलएलपी सिस्टम 33,34 मध्ये पाहिले जाते.हे प्रथिने युक्त थेंब NaCl (1 M) साठी संवेदनशील होते परंतु 1,6-HD (10% v/v) साठी नाही, त्यांच्या इलेक्ट्रोस्टॅटिक गुणधर्मांची पुष्टी करतात (पूरक चित्र 2a, b).BF मायक्रोस्कोपी (Fig. 2b) वापरून मिलीसेकंद विलीन होणाऱ्या थेंबाच्या घटनांचे निरीक्षण करून त्यांच्या द्रव वर्तनाची पुष्टी केली गेली.
LLPS बफरमध्ये αS/Tau441 coacervates च्या Confocal (CF) मायक्रोस्कोपी प्रतिमा (प्रत्येक प्रोटीनचे 10 μM, AF488-लेबल केलेले αS चे 0.5 μM आणि Atto647N-लेबल केलेले Tau441).b αS/Tau441 ड्रॉपलेट फ्यूजन इव्हेंट (प्रत्येक प्रोटीनसाठी 10 μM) च्या प्रतिनिधी विभेदक हस्तक्षेप कॉन्ट्रास्ट (DIC) प्रतिमा.50 µM αS च्या अनुपस्थितीत (डावीकडे) किंवा उपस्थिती (उजवीकडे) Tau441 LLPS (0–15 µM) च्या प्रकाश विखुरण्याच्या (350 nm वर) आधारावर c फेज आकृती.उबदार रंग अधिक विखुरलेले सूचित करतात.d वाढत्या αS एकाग्रतेसह αS/Tau441 LLPS नमुन्यांचे हलके विखुरणे (5 µM वर Tau441, N = 2–3 नमुना पुनरावृत्ती दर्शविल्यानुसार).e या अभ्यासात वापरल्या जाणार्‍या काही टाऊ प्रोटीन प्रकारांचे आणि प्रथिनांच्या विविध क्षेत्रांचे योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व: नकारात्मक चार्ज केलेले एन-टर्मिनल डोमेन (लाल), प्रोलाइन-रिच क्षेत्र (निळा), मायक्रोट्यूब्यूल-बाइंडिंग डोमेन (एमटीबीडी, नारिंगीमध्ये हायलाइट केलेले), आणि amyloid-फॉर्मिंग जोडी सर्पिल.MTBD (राखाडी) मध्ये स्थित फिलामेंट क्षेत्रे (PHF).Tau441 चा निव्वळ शुल्क प्रति अवशेष (NCPR) नकाशा दर्शविला आहे.f 1 µM AF488-लेबल केलेले αS आणि Atto647N-लेबल केलेले ΔNt- वापरणे, ΔNt-Tau (शीर्ष, 10 μM प्रति प्रोटीन) किंवा K18 (प्रति µM μM प्रति प्रोटीन), 1 μM AF488-लेबल केलेले αS किंवा ΔCt-αS वापरणे ) ) ) LLPS किंवा K18 बफरमध्ये कंडेन्स केलेले WF चे मायक्रोग्राफ.एका प्रतिमेतील स्केल बार एका पॅनेलमधील सर्व प्रतिमांचे प्रमाण दर्शवतात (पॅनल a, b आणि f साठी 20 µm).c आणि d पॅनेलसाठी कच्चा डेटा रॉ डेटा फाइल्स म्हणून प्रदान केला जातो.
या LLPS प्रक्रियेत αS ची भूमिका तपासण्यासाठी, आम्ही प्रथम NaCl (Fig. 2c) च्या वाढत्या एकाग्रतेचा वापर करून नेफेलोमेट्रीद्वारे थेंबाच्या स्थिरतेवर αS चा प्रभाव तपासला.αS असलेल्या नमुन्यांमध्ये मीठ एकाग्रता जितकी जास्त असेल तितकी जास्त प्रकाश विखुरणारी मूल्ये (350 nm वर), जी या LLPS प्रणालीमध्ये αS ची स्थिर भूमिका दर्शवते.αS एकाग्रता (आणि म्हणून αS:Tau441 प्रमाण) अंदाजे वाढवून असाच परिणाम दिसून येतो.ताऊ एकाग्रता (5 µM) (Fig. 2d) च्या तुलनेत 10 पट वाढ.coacervates मध्ये αS हे स्कॅफोल्ड प्रोटीन आहे हे दाखवण्यासाठी, आम्ही LLPS-विस्कळीत Tau mutant च्या वर्तनाची तपासणी करण्याचा निर्णय घेतला, ज्यामध्ये ΔNt-Tau नावाचा नकारात्मक चार्ज असलेला N-टर्मिनल प्रदेश (अवशेष 1-150, चित्र 2e पहा) नाही.WF मायक्रोस्कोपी आणि नेफेलोमेट्रीने पुष्टी केली की ΔNt-Tau स्वतः LLPS (Fig. 2f आणि Supplementary Fig. 2d) मधून जात नाही, जसे की आधी नोंदवले गेले 14. तथापि, जेव्हा αS या कापलेल्या Tau प्रकाराच्या फैलाव सोल्यूशन्समध्ये जोडले गेले तेव्हा LLPS प्रक्रिया पूर्णपणे पूर्ण झाली. समान परिस्थिती आणि प्रथिने एकाग्रता अंतर्गत Tau आणि αS च्या पूर्ण-आकाराच्या द्रावणांच्या ड्रॉपलेट घनतेच्या जवळ थेंब घनतेसह पुनर्संचयित केले.ही प्रक्रिया कमी मॅक्रोमोलेक्युलर गर्दीच्या परिस्थितीत देखील पाहिली जाऊ शकते (पूरक अंजीर 2c).सी-टर्मिनल αS क्षेत्राची भूमिका, परंतु त्याची संपूर्ण लांबी नाही, LLPS प्रक्रियेत (ΔCt-) च्या अवशेष 104-140 (चित्र 1a) नसलेल्या सी-टर्मिनल ट्रंकेटेड αS प्रकाराचा वापर करून थेंब निर्मितीच्या प्रतिबंधाद्वारे प्रदर्शित केले गेले. αS) प्रथिने (Fig. 2f आणि पूरक Fig. 2d).αS आणि ΔNt-Tau चे स्थानिकीकरण कॉन्फोकल फ्लोरोसेन्स मायक्रोस्कोपी (पूरक अंजीर 1b) द्वारे पुष्टी केली गेली.
Tau441 आणि αS मधील LLPS यंत्रणेची पुढील चाचणी करण्यासाठी, अतिरिक्त Tau प्रकार वापरला गेला, म्हणजे मायक्रोट्यूब्यूल-बाइंडिंग डोमेन (MTBD) मध्ये पेअर केलेले हेलिकल फिलामेंट कोअर (PHF) तुकडा, ज्यामध्ये चार वैशिष्ट्यपूर्ण पुनरावृत्ती डोमेन असल्यास, सामान्यतः देखील ओळखले जाते. K18 तुकड्याप्रमाणे (चित्र 2e पहा).नुकतेच असे नोंदवले गेले आहे की αS प्राधान्याने प्रोलाइन-समृद्ध डोमेनमध्ये असलेल्या टाऊ प्रोटीनला जोडते जे मायक्रोट्यूब्यूल-बाइंडिंग डोमेनच्या आधी असते.तथापि, PHF क्षेत्र सकारात्मक चार्ज केलेले अवशेष (आकृती 2e पहा), विशेषत: लाइसिन (15% अवशेष) ने समृद्ध आहे, ज्यामुळे हा प्रदेश αS/Tau कॉम्प्लेक्सच्या संक्षेपणात देखील योगदान देतो की नाही हे तपासण्यास प्रवृत्त करतो.आम्ही निरीक्षण केले की एकटे K18 चाचणी केलेल्या परिस्थितीत 100 μM पर्यंत एकाग्रतेवर LLPS ट्रिगर करू शकत नाही (15% PEG किंवा 20% dextran सह LLPS बफर) (आकृती 2f).तथापि, जेव्हा आम्ही 50 µM K18 ला 50 µM αS जोडले, तेव्हा K18 आणि αS असलेल्या प्रथिने थेंबांची जलद निर्मिती नेफेलोमेट्री (पूरक अंजीर 2d) आणि WF मायक्रोस्कोपी (चित्र 2f) द्वारे दिसून आली.अपेक्षेप्रमाणे, ΔCt-αS K18 (Fig. 2f) चे LLPS वर्तन पुनर्संचयित करण्यात अक्षम होते.आम्ही लक्षात घेतो की αS/ΔNt-Tau किंवा αS/Tau441 च्या तुलनेत αS/K18 एकत्रीकरणाला LLPS प्रवृत्त करण्यासाठी किंचित जास्त प्रथिने सांद्रता आवश्यक आहे, इतर गोष्टी समान आहेत.हे मायक्रोट्यूब्यूल-बाइंडिंग डोमेनच्या तुलनेत प्रोलाइन-समृद्ध टाऊ डोमेनसह αS C-टर्मिनल क्षेत्राच्या मजबूत परस्परसंवादाशी सुसंगत आहे, पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे 31.
ΔNt-Tau αS च्या अनुपस्थितीत LLPS करू शकत नाही हे लक्षात घेऊन, पूर्ण-लांबीच्या Tau (isotype, Tau441/Tau441) सह LLPS सिस्टीममध्ये साधेपणा दिल्याने αS/Tau LLPS चे वैशिष्ट्य दर्शवण्यासाठी आम्ही हा Tau प्रकार निवडला.जटिल (हेटरोटाइपिक, αS/Tau441) एकत्रीकरण प्रक्रियेसह.आम्‍ही αS/Tau आणि αS/ΔNt-Tau सिस्‍टममध्‍ये सेंट्रीफ्यूगेशन आणि विखुरलेल्या फेज SDS-PAGE विश्‍लेषणाद्वारे (कंडेन्स्ड फेज प्रोटीन, fαS,c चा भाग म्हणून) αS एकत्रीकरणाच्या डिग्रीची तुलना केली (पहा 2e), खूप समान मूल्ये आढळली. सर्व प्रथिनांसाठी समान एकाग्रता.विशेषतः, आम्ही αS/Tau आणि αS/ΔNt-Tau साठी अनुक्रमे fαS,c 84 ± 2% आणि 79 ± 7% प्राप्त केले, जे सूचित करते की αS आणि tau मधील विषमता परस्परसंवाद टाऊ रेणूंमधील परस्परसंवादापेक्षा श्रेष्ठ आहे.यांच्यातील.
विविध पॉलीकेशन्ससह परस्परसंवाद आणि αS गतिशास्त्रावरील संक्षेपण प्रक्रियेचा प्रभाव प्रथम फोटोब्लीचिंग (FRAP) पद्धतीनंतर फ्लोरोसेन्स पुनर्प्राप्तीद्वारे अभ्यासला गेला.आम्ही αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau आणि αS/pLK coacervates (100 μM αS 2 μM αS AF488-αS आणि 100 μM Tau441 किंवा ΔNt-Tau किंवा 1 mM pLK सह पूरक) ची चाचणी केली.नमुना घटक मिसळल्यानंतर पहिल्या 30 मिनिटांत डेटा प्राप्त झाला.प्रातिनिधिक FRAP प्रतिमा (Fig. 3a, αS/Tau441 कंडेन्सेशन) आणि त्यांच्याशी संबंधित टाइम कोर्स वक्र (Fig. 3b, पूरक Fig. 3) वरून असे दिसून येते की αS गतिशास्त्र हे Tau441 coacervates सारखेच आहेत.आणि ΔNt-Tau, जे pLK सह खूप वेगवान आहे.FRAP (Kang et al. 35 ने वर्णन केल्याप्रमाणे) coacervate च्या आत αS साठी गणना केलेले प्रसार गुणांक D = 0.013 ± 0.009 µm2/s आणि D = 0.026 ± 0.008 µm2/s αS/TauΔ साठी αS/TauΔ साठी आहेत αS/ प्रणाली.pLK, Tau, आणि D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, अनुक्रमे (Fig. 3c).तथापि, विखुरलेल्या अवस्थेतील प्रसार गुणांक αS हे सर्व घनरूप टप्प्यांपेक्षा अधिक परिमाणाचे अनेक आदेश आहेत, ज्याप्रमाणे फ्लोरोसेन्स कोरिलेशन स्पेक्ट्रोस्कोपी (FCS, सप्लिमेंटरी अंजीर 3 पहा) समान परिस्थितीत (LLPS बफर) परंतु पॉलीकेशन्सच्या अनुपस्थितीत. ( D = 8 ± 4 µm2/s).म्हणून, αS भाषांतराचे गतिशास्त्र उच्चारित आण्विक क्राउडिंग इफेक्ट्समुळे पसरलेल्या अवस्थेतील प्रथिनांच्या तुलनेत coacervates मध्ये लक्षणीयरीत्या कमी होते, जरी सर्व coacervates त्यांच्या निर्मितीनंतर पहिल्या अर्ध्या तासात द्रव सारखे गुणधर्म टिकवून ठेवतात, तौ टप्प्याच्या उलट.pLK कंडेन्सेटमध्ये वेगवान गतीशास्त्र.
इलेक्ट्रोस्टॅटिक कोसेर्व्हेट्समध्ये αS डायनॅमिक्सचे (2% AF488-लेबल केलेले αS) a–c FRAP विश्लेषण.αS/Tau441 FRAP assess च्या तीन प्रतिलिपीत प्रातिनिधिक प्रतिमा (a), जेथे लाल वर्तुळे रंगीत क्षेत्र दर्शवितात.स्केल बार 5 µm आहे.b सरासरी FRAP वक्र आणि (c) 100 µM αS आणि Tau441 (लाल) किंवा ΔNt-Tau (निळा) किंवा pLK (हिरवा) वापरून तीन प्रयोगांमधून 5-6 (N) भिन्न थेंबांसाठी गणना केलेले प्रसार गुणांक (D) LLPS च्या दहापट एकाग्रता.FRAP वक्रचे मानक विचलन छायांकित रंगात दर्शविले आहे.तुलनेसाठी, विखुरलेल्या टप्प्यातील प्रसार गुणांक αS फ्लूरोसेन्स कोरिलेशन स्पेक्ट्रोस्कोपी (FCS) वापरून त्रिगुणांमध्ये निर्धारित केले गेले (अधिक माहितीसाठी पूरक आकृती 3 आणि पद्धती पहा).d कोणत्याही पॉलीकेशन (काळा) शिवाय LLPS बफरमध्ये 100 μM TEMPOL-122-αS चा सतत X-बँड EPR स्पेक्ट्रा किंवा 100 μM Tau441 (लाल) किंवा ΔNt-Tau (निळा) किंवा 1 mM pLK (हिरवा) च्या उपस्थितीत.इनसेट मजबूत फील्ड रेषांचे एक मोठे दृश्य दर्शविते जेथे सर्वात नाट्यमय बदल घडतात.e 50 μM TEMPOL-122-αS चे बंधनकारक वक्र LLPS च्या अनुपस्थितीत विविध पॉलीकेशनसह (PEG नाही).सामान्यीकृत ईपीआर स्पेक्ट्रमच्या बँड II (IIII/III) च्या तुलनेत बँड III चे कमी झालेले मोठेपणा Tau441 (लाल), ΔNt-Tau (निळा) आणि pLK (हिरवा) चे दाढ गुणोत्तर वाढवते.रंगीत रेषा प्रत्येक वक्र वर n समान आणि स्वतंत्र बाइंडिंग साइटसह रफ बाइंडिंग मॉडेल वापरून डेटासाठी योग्य दर्शवतात.कच्चा डेटा रॉ डेटा फाइल्सच्या स्वरूपात प्रदान केला जातो.
एक पूरक म्हणून, आम्ही डायरेक्टेड स्पिन लेबलिंग (SDSL) आणि सतत इलेक्ट्रॉन पॅरामॅग्नेटिक रेझोनान्स (CW-EPR) वापरून विविध coacervates मध्ये αS च्या गतिशीलतेची तपासणी केली.ही पद्धत IDP ची लवचिकता आणि गतिशीलता 36,37,38 रिझोल्यूशनसह रिअॅलिस्टिक रिझोल्यूशनसह अहवाल देण्यासाठी खूप उपयुक्त असल्याचे सिद्ध झाले आहे.यासाठी, आम्ही सिंगल सायस म्युटंट्समध्ये सिस्टीन अवशेष तयार केले आणि 4-हायड्रॉक्सी-2,2,6,6-टेट्रामेथिलपिपेरिडाइन-एन-ऑक्सिल (TEMPOL) स्पिन प्रोबचा वापर केला.Maleimide डेरिव्हेटिव्ह्ज त्यांना लेबल करतात.अधिक विशिष्टपणे, आम्ही 122 किंवा 24 αS (TEMPOL-122-αS आणि TEMPOL-24-αS) स्थानावर TEMPOL प्रोब समाविष्ट केले.पहिल्या प्रकरणात, आम्ही प्रथिनेच्या सी-टर्मिनल क्षेत्राला लक्ष्य करतो, जे पॉलीकेशन्ससह परस्परसंवादात गुंतलेले आहे.त्याऐवजी, स्थान 24 आम्हाला कंडेनसेटमधील प्रथिनांच्या एकूण गतिशीलतेबद्दल माहिती देऊ शकते.दोन्ही प्रकरणांमध्ये, विखुरलेल्या टप्प्यातील प्रथिनांसाठी प्राप्त केलेले ईपीआर सिग्नल जलद गतीच्या स्थितीत नायट्रोक्साइड रॅडिकल्सशी संबंधित होते.टाऊ किंवा pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 किंवा ΔNt-Tau 1:1 च्या प्रमाणात किंवा pLK 1:10 च्या प्रमाणात) च्या उपस्थितीत फेज विभक्त झाल्यानंतर, सापेक्ष शिखर तीव्रतेमध्ये वाढ दिसून आली. αS चे EPR स्पेक्ट्रम.तोटा रेषा रुंद झाली, जे सौम्य अवस्थेतील प्रथिनांच्या तुलनेत थेंबांमध्ये कमी झालेले αS रीओरिएंटेशन गतीशास्त्र दर्शवते (चित्र 3d, पूरक अंजीर 4a).हे बदल 122 व्या स्थानावर अधिक स्पष्ट होतात. स्थान 24 वर असताना pLK च्या उपस्थितीचा प्रोबच्या गतीशास्त्रावर परिणाम झाला नाही, तर स्थान 122 वर वर्णक्रमीय रेषेचा आकार लक्षणीय बदलला (पूरक चित्र 4a).जेव्हा आम्ही स्पिन-लेबल केलेल्या IDP38,39 च्या गतिशीलतेचे वर्णन करण्यासाठी सामान्यतः वापरल्या जाणार्‍या आइसोट्रॉपिक मॉडेल (पूरक आकृती 5a) वापरून दोन αS/पॉलिकेशन सिस्टम्सच्या 122 क्रमांकावर स्पेक्ट्राचे मॉडेल करण्याचा प्रयत्न केला, तेव्हा आम्ही प्रायोगिक स्पेक्ट्राची पुनर्रचना करण्यात अक्षम होतो..24 स्पिन कॉन्ट्रास्टच्या स्थितीचे स्पेक्ट्रल सिम्युलेशन (पूरक अंजीर 5a).हे सूचित करते की पॉलीकेशन्सच्या उपस्थितीत αS च्या C-टर्मिनल क्षेत्राच्या स्पिन कॉन्फिगरेशनच्या जागेत प्राधान्य स्थान आहे.प्रायोगिक EPR परिस्थितीत कंडेन्स्ड टप्प्यात αS च्या अंशाचा विचार करताना (αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, आणि αS/pLK साठी अनुक्रमे 84 ± 2%, 79 ± 7%, आणि 47 ± 4%) - पूरक पहा आकृती 2e डेटा विश्लेषण c), हे पाहिले जाऊ शकते की EPR पद्धतीद्वारे आढळलेले विस्तृतीकरण मुख्यत्वे αS च्या C-टर्मिनल क्षेत्राचा संक्षेप टप्प्यातील विविध पॉलीकेशनसह परस्परसंवाद दर्शवते (TEMPOL-122 वापरताना मुख्य बदल. αS), आणि प्रथिने संक्षेपण नाही.तपासणीमध्ये मायक्रोव्हिस्कोसिटीमध्ये वाढ दिसून येते.अपेक्षेप्रमाणे, LLPS व्यतिरिक्त इतर परिस्थितीत प्रोटीनचा EPR स्पेक्ट्रम पूर्णपणे पुनर्संचयित झाला जेव्हा मिश्रणात 1 M NaCl जोडला गेला (पूरक अंजीर 4b).एकंदरीत, आमचा डेटा सूचित करतो की CW-EPR द्वारे आढळलेले बदल प्रामुख्याने αS च्या C-टर्मिनल प्रदेशातील विविध पॉलीकेशन्ससह संक्षेपित टप्प्यातील परस्परसंवाद दर्शवतात आणि हा परस्परसंवाद Tau पेक्षा pLK सह अधिक मजबूत असल्याचे दिसून येते.
कोसरवेटमधील प्रथिनांची अधिक संरचनात्मक माहिती मिळविण्यासाठी, आम्ही द्रावणात NMR वापरून LLPS प्रणालीचा अभ्यास करण्याचे ठरवले.तथापि, आम्ही केवळ विखुरलेल्या अवस्थेत उरलेला αS अंश शोधू शकलो, जे कोसरवेटच्या आत प्रोटीन डायनॅमिक्स कमी झाल्यामुळे आणि NMR विश्लेषणामध्ये सोल्यूशनच्या तळाशी दाट टप्पा असू शकतो.जेव्हा आम्ही NMR (पूरक Fig. 5c, d) वापरून LLPS नमुन्याच्या विखुरलेल्या अवस्थेत उरलेल्या प्रथिनांची रचना आणि गतिशीलतेचे विश्लेषण केले, तेव्हा आमच्या लक्षात आले की pLK आणि ΔNt-Tau च्या उपस्थितीत प्रथिने जवळजवळ एकसारखेच वागले. जे प्रथिने पाठीच्या कण्यातील दुय्यम संरचना आणि गतिशीलतेमध्ये होते, दुय्यम रासायनिक शिफ्ट आणि R1ρ विश्रांतीवरील प्रयोगांद्वारे प्रकट झाले.NMR डेटा दर्शवितो की αS च्या C-टर्मिनसला त्याच्या पॉलीकेशन्ससह परस्परसंवादामुळे, उर्वरित प्रथिने क्रमांप्रमाणे त्याचे विस्कळीत स्वरूप टिकवून ठेवताना संरचनात्मक लवचिकतेचे लक्षणीय नुकसान होते.
TEMPOL-122-αS कंडेन्स्ड फेजमध्ये CW-EPR सिग्नल ब्रॉडिंग पाळण्यात आल्याने पॉलीकेशन्ससह प्रोटीनचा परस्परसंवाद प्रतिबिंबित होतो, आम्ही LLPS च्या अनुपस्थितीत विविध पॉलीकेशन्सशी αS च्या बंधनकारक आत्मीयतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी एक EPR टायट्रेशन केले (कोणतेही संचय नाही बफर एलएलपीएस), हे सूचित करते की संवाद सौम्य आणि केंद्रित टप्प्यांमध्ये समान असतात (ज्याला आमच्या डेटाद्वारे पुष्टी मिळते, पूरक अंजीर. 4a आणि पूरक अंजीर. 6).सर्व कोसर्व्हेट्स, त्यांच्या सामान्य द्रवासारखे गुणधर्म असूनही, आण्विक स्तरावर कोणतेही अंतर्निहित विभेदक वर्तन प्रदर्शित करतात का हे पाहणे हे ध्येय होते.अपेक्षेप्रमाणे, EPR स्पेक्ट्रम वाढत्या पॉलीकेशन एकाग्रतेसह विस्तृत झाले, जवळजवळ संपृक्ततेपर्यंत सर्व परस्पर भागीदारांच्या आण्विक परस्परसंवादामुळे आण्विक लवचिकतेत घट दिसून येते (चित्र 3e, पूरक आकृती. 6).pLK ने हे संपृक्तता ΔNt-Tau आणि Tau441 च्या तुलनेत कमी मोलर रेशोवर (polycation:αS) गाठले.खरं तर, n समान आणि स्वतंत्र बंधनकारक साइट गृहीत धरून अंदाजे बंधनकारक मॉडेलसह डेटाची तुलना दर्शविते की pLK (~5 μM) चे स्पष्ट पृथक्करण स्थिरांक Tau441 किंवा ΔNt-Tau (~50 μM) पेक्षा कमी परिमाणाचा क्रम आहे ).µM).जरी हा ढोबळ अंदाज असला तरी, हे सूचित करते की αS मध्ये सतत सकारात्मक चार्ज क्षेत्रांसह सोप्या पॉलीकेशन्ससाठी उच्च आत्मीयता आहे.αS आणि विविध पॉलीकेशन्समधील आत्मीयतेतील हा फरक लक्षात घेता, आम्ही असे गृहित धरले की त्यांचे द्रव गुणधर्म कालांतराने वेगळ्या प्रकारे बदलू शकतात आणि अशा प्रकारे वेगवेगळ्या LSPT प्रक्रियांना बळी पडतात.
प्रोटीन कोसरवेटमधील अत्यंत गर्दीचे वातावरण आणि प्रथिनांचे अमायलोइड स्वरूप लक्षात घेता, संभाव्य LSPT प्रक्रिया शोधण्यासाठी आम्ही कालांतराने कोसरवेटच्या वर्तनाचे निरीक्षण केले.BF आणि CF मायक्रोस्कोपी (आकृती 4) वापरून, आम्ही निरीक्षण केले की αS/Tau441 मोठ्या प्रमाणात द्रावणात एकत्रित होते, मोठ्या थेंब तयार करतात जे विहिरीच्या तळाशी संपर्क साधतात आणि ओले करतात आणि पूर्ण थेंब म्हणून स्लाइड करतात, अपेक्षेप्रमाणे (पूरक अंजीर 7d);या तळाशी बनलेल्या रचनांना आपण “प्रोटीन राफ्ट्स” म्हणतो.या संरचना द्रवपदार्थ राहिल्या कारण त्यांनी फ्यूज करण्याची क्षमता (पूरक अंजीर 7b) कायम ठेवली आणि LLPS सुरू झाल्यानंतर अनेक तास दिसू शकले (चित्र 4 आणि पूरक आकृती 7c).असंतुलित शुल्क आणि त्यामुळे उच्च इलेक्ट्रोस्टॅटिक पृष्ठभाग क्षमता असलेल्या इलेक्ट्रोस्टॅटिक कोसेर्व्हेटसाठी अपेक्षेनुसार हायड्रोफोबिक पदार्थांऐवजी हायड्रोफिलिकच्या पृष्ठभागावर ओले करण्याची प्रक्रिया अधिक अनुकूल आहे (पूरक चित्र 7a)उल्लेखनीय म्हणजे, αS/ΔNt-Tau एकत्रीकरण आणि राफ्टिंग लक्षणीयरीत्या कमी झाले, तर αS/pLK कंडेन्सेट लक्षणीयरीत्या कमी झाले (चित्र 4).लहान उष्मायन वेळेत, αS/pLK थेंब हायड्रोफिलिक पृष्ठभागावर एकत्र आणि ओले करण्यास सक्षम होते, परंतु ही प्रक्रिया त्वरीत थांबली आणि उष्मायनाच्या 5 तासांनंतर, केवळ मर्यादित एकत्रीकरण घटना आणि कोणतेही ओले होणे दिसून आले नाही.- जेल-ड्रिप संक्रमण.
प्रतिनिधी BF (ग्रेस्केल पॅनेल्स) आणि CF (उजवे पॅनेल, हिरव्या रंगात AF488-लेबल केलेले αS) 100 µM αS (1% फ्लूरोसंट लेबल) असलेल्या LLPS बफरमध्ये 100 µM मायक्रोटॉप इमेज (Tau41Fluscoore) 100 µM αS (1% फ्लूरोसंट लेबल) असलेल्या कोसरव्हेट नमुन्यांची -ताऊ (मध्यभागी) किंवा 1 mM pLK (तळाशी) वेगवेगळ्या उष्मायन वेळी आणि फोकल उंचीवर (z, प्लेटच्या तळापासून अंतर).समान परिणामांसह प्रयोग स्वतंत्रपणे 4-6 वेळा पुनरावृत्ती झाले.αS/Tau441 coacervates 24 तासांनंतर ओले होतात, ज्यामुळे प्रतिमेपेक्षा मोठा तराफा तयार होतो.सर्व प्रतिमांसाठी स्केल बार 20 µm आहे.
त्यानंतर आम्ही विचारले की αS/Tau441 LLPS मध्ये तयार झालेल्या मोठ्या द्रव-सदृश प्रथिने पूलमुळे अभ्यास केलेल्या कोणत्याही प्रथिनांचे अमायलोइड एकत्रीकरण होईल का.आम्ही वरील प्रमाणेच WF मायक्रोस्कोपीसह कालांतराने αS/Tau441 थेंबांच्या परिपक्वताचे अनुसरण केले, परंतु 1 μM AF488-लेबल केलेले αS आणि Atto647N-लेबल केलेले Tau441 (चित्र 5a) वापरून.अपेक्षेप्रमाणे, आम्ही संपूर्ण परिपक्वता प्रक्रियेदरम्यान संपूर्ण प्रथिने स्थानिकीकरण पाहिले.विशेष म्हणजे, ca.5 तासांनंतर, तराफांच्या आत अधिक तीव्र नॉन-गोलाकार रचना दिसून आल्या, ज्यांना आम्ही "बिंदू" म्हणतो, त्यापैकी काही αS सह एकत्रित केले गेले होते, आणि काही Tau441 (Fig. 5a, पांढरे बाण) मध्ये समृद्ध होते.हे स्पॉट्स नेहमी αS/ΔNt-Tau साठी αS/ΔNt-Tau पेक्षा जास्त प्रमाणात तराफांमध्ये आढळतात.फ्यूजन/ओले करण्यासाठी अक्षम pLK आणि Tau प्रणालीच्या थेंबांमध्ये कोणतेही वेगळे स्पॉट्स नव्हते.αS आणि Tau441 असलेले हे डाग amyloid सारखे समुच्चय आहेत की नाही हे तपासण्यासाठी, आम्ही CF मायक्रोस्कोपी वापरून एक समान प्रयोग केला ज्यामध्ये Tau441 ला Atto647N असे लेबल केले गेले आणि 12.5 μM amyloid-विशिष्ट thioflavin-T (ThT) सुरुवातीपासून जोडले गेले.रंगजरी 24 तास उष्मायनानंतरही αS/Tau441 थेंब किंवा राफ्ट्सचे ThT-स्टेनिंग दिसून आले नाही (चित्र. 5b, शीर्ष पंक्ती—प्रथिन राफ्ट्सवरील उर्वरित थेंब), तराफ्टच्या आत Atto647N-Tau441 असलेली ThT-पॉझिटिव्ह संरचना खूपच कमकुवत होती.हे पूर्वी वर्णन केलेल्या स्पॉट्सचे आकार, आकार आणि स्थान (चित्र 5b, मधली आणि खालच्या पंक्ती) ची प्रतिकृती बनवते, असे सूचित करते की हे डाग वृद्धत्वाच्या द्रवपदार्थाच्या कोसरवेट्समध्ये तयार झालेल्या अमायलोइड सारख्या समुच्चयांशी संबंधित असू शकतात.
LLPS buffer सह मायक्रोस्कोप प्लेटच्या विहिरीत 25 μM Tau441 (1 μM AF488-लेबल αS आणि Atto647N-लेबल केलेले Tau441) च्या उपस्थितीत विविध उष्मायन वेळा आणि फोकल हाइट्स (z, अनबाउंड तळापासून अंतर) येथे WF 25 μM αS) .समान परिणामांसह सहा प्रयोग स्वतंत्रपणे पुनरावृत्ती झाले.b 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-लेबल केलेले Tau441) आणि 12.5 μM thioflavin-T (ThT) च्या उपस्थितीत 25 μM αS ची CF सूक्ष्म प्रतिमा.भारित प्रोटीन थेंब आणि जमा प्रोटीन राफ्ट्स आणि स्पॉट्स अनुक्रमे वरच्या आणि मधल्या पंक्तीमध्ये दर्शविले आहेत.तळाची पंक्ती 3 स्वतंत्र प्रतिकृतींमधून तराफा आणि थेंबांच्या प्रतिमा दर्शवते.पांढरे बाण दोन्ही पॅनेलमध्ये ThT-पॉझिटिव्ह ठिपके दर्शवतात.सर्व प्रतिमांसाठी स्केल बार 20 µm आहे.
द्रव ते घन मध्ये संक्रमणादरम्यान कोसरवेट प्रोटीन नेटवर्कमधील बदलांचे अधिक तपशीलवार परीक्षण करण्यासाठी, आम्ही फ्लूरोसेन्स लाइफटाइम इमेजिंग (FLIM) आणि Förster रेझोनान्स एनर्जी ट्रान्सफर मायक्रोस्कोपी (FRET) (आकृती 6 आणि पूरक आकडे 8 आणि 9) वापरले.आम्‍ही असे गृहित धरले की लेयरचे कोसरवेट मॅच्युरेशन अधिक घनरूप किंवा अगदी घन-सदृश एकत्रित प्रथिने संरचनेत प्रथिने आणि त्यास जोडलेले फ्लोरोसेंट प्रोब यांच्यात जवळचा संपर्क निर्माण करते, संभाव्यत: कमी केलेल्या प्रोबच्या जीवनकाळात प्रकट होणारा शमन प्रभाव निर्माण करते (τ) , पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे 40.४१,४२.या व्यतिरिक्त, दुहेरी लेबल केलेल्या नमुन्यांसाठी (AF488 आणि Atto647N अनुक्रमे FRET दाता आणि स्वीकारकर्ता रंग म्हणून), τ मधील ही घट LSPT दरम्यान coacervate कंडेन्सेशन आणि FRET(E) कार्यक्षमतेत वाढ देखील असू शकते.आम्ही LLPS αS/Tau441 आणि αS/ΔNt-Tau नमुन्यांमध्ये कालांतराने राफ्ट आणि स्पॉट फॉर्मेशनचे निरीक्षण केले (LLPS बफरमधील प्रत्येक प्रोटीनचे 25 µM 1 µM AF488 लेबल केलेले αS आणि/किंवा Atto647N लेबल केलेले Tau441 किंवा ΔNt-Tau).आम्‍ही AF488 (τ488) आणि Atto647N (τ647N) प्रोबचे फ्लूरोसेन्स लाइफटाईम कोसेर्व्हेट्स परिपक्व झाल्यामुळे किंचित कमी झाले (Fig. 6 आणि पूरक Fig. 8c) मध्ये एक सामान्य प्रवृत्ती पाहिली.विशेष म्हणजे, हा बदल राफ्ट्स (Fig. 6c) मधील ठिपक्यांसाठी लक्षणीयरीत्या वर्धित करण्यात आला होता, हे दर्शविते की डॉट्सवर पुढील प्रोटीन संक्षेपण झाले आहे.याच्या समर्थनार्थ, 24 तास वयाच्या αS/ΔNt-Tau थेंबांसाठी फ्लूरोसेन्स जीवनकाळात कोणताही महत्त्वपूर्ण बदल दिसून आला नाही (पूरक चित्र 8d), असे सूचित करते की ड्रॉपलेट जेलेशन ही स्पॉटिंगपेक्षा वेगळी प्रक्रिया आहे आणि ती लक्षणीय आण्विक पुनर्रचनासह नाही. coacervates आत.हे नोंद घ्यावे की αS मध्ये ठिपके भिन्न आकार आणि परिवर्तनीय सामग्री आहेत, विशेषत: αS/Tau441 प्रणालीसाठी (पूरक अंजीर. 8e).स्पॉट फ्लूरोसेन्स लाइफटाईममध्ये घट झाल्यामुळे तीव्रता वाढली, विशेषत: Atto647N लेबल असलेल्या Tau441 (पूरक अंजीर 8a), आणि αS/Tau441 आणि αS/ΔNt-Tau या दोन्ही प्रणालींसाठी उच्च FRET कार्यक्षमता, पुढील संक्षेपण पाच तासांमध्ये सूचित करते. ट्रिगर केल्यानंतर, स्थिर विद्युत् आतील प्रथिने घनरूप होतात.αS/ΔNt-Tau च्या तुलनेत, आम्ही αS/Tau441 स्पॉट्समध्ये कमी τ647N आणि काहीसे जास्त τ488 मूल्ये पाहिली, ज्यामध्ये कमी आणि अधिक एकसमान FRET मूल्ये आहेत.शक्यतो, हे या वस्तुस्थितीशी संबंधित असू शकते की αS/Tau441 प्रणालीमध्ये, निरीक्षण केलेले आणि अपेक्षित αS विपुलता अधिक विषम आहे, बहुतेक वेळा Tau च्या तुलनेत substoichiometric आहे, कारण Tau441 ला LLPS आणि एकत्रीकरण देखील होऊ शकते (पूरक चित्र 8e) .तथापि, जेव्हा Tau441 आणि αS दोन्ही उपस्थित असतात तेव्हा थेंब एकत्र करणे, तराफा तयार करणे आणि महत्त्वाचे म्हणजे द्रव-सदृश कोसर्वेट्समध्ये प्रथिने एकत्रीकरणाची डिग्री जास्तीत जास्त असते.
αS/Tau441 आणि αS/ΔNt-Tau च्या लाइफटाइम फ्लूरोसेन्स मायक्रोस्कोपी (FLIM) प्रतिमा प्रत्येक प्रोटीनच्या 25 μM वर (1 μM AF488-लेबल केलेले αS आणि 1 μM Atto647N-लेबल केलेले Tau441 किंवा ΔNt-Tau LLPS buff) मध्ये.स्तंभ वेगवेगळ्या परिपक्वता वेळी (30 मिनिटे, 5 तास आणि 24 तास) LLPS नमुन्यांची प्रतिनिधी प्रतिमा दर्शवतात.लाल फ्रेम αS/Tau441 स्पॉट्स असलेला प्रदेश दाखवते.लाइफ स्पॅन कलर पट्ट्या म्हणून दर्शविले आहेत.सर्व प्रतिमांसाठी स्केल बार = 20 µm.b निवडलेल्या क्षेत्राची झूम-इन FLIM प्रतिमा, पॅनेल a मधील लाल बॉक्समध्ये दर्शविली आहे.लाइफ रेंज पॅनेल a प्रमाणेच रंग स्केल वापरून दाखवल्या आहेत.स्केल बार = 5 µm.c हिस्टोग्राम AF488 (αS ला जोडलेले) किंवा Atto647N (Tau ला जोडलेले) दर्शविणारे विविध प्रथिने प्रजातींसाठी (droplets-D-, raft-R- आणि speckle-P) FLIM प्रतिमांमध्ये ओळखले गेलेले αS- साठी रेकॉर्ड केलेले Tau441 आणि आयुष्यभर वेळ वितरण αS/ΔNt-Tau coacervate नमुने (D साठी N = 17-32 ROI, R साठी 29-44 ROI आणि गुणांसाठी 21-51 ROI).मध्य आणि मध्यवर्ती मूल्ये बॉक्समध्ये अनुक्रमे पिवळे चौरस आणि काळ्या रेषा म्हणून दर्शविली जातात.बॉक्सच्या खालच्या आणि वरच्या सीमा अनुक्रमे प्रथम आणि तृतीय चतुर्थांश दर्शवितात आणि 1.5-पट इंटरक्वार्टाइल रेंज (IQR) मधील किमान आणि कमाल मूल्ये व्हिस्कर्स म्हणून दर्शविली जातात.आउटलियर काळे हिरे म्हणून दाखवले आहेत.वितरणाच्या जोड्यांमधील सांख्यिकीय महत्त्व दोन-नमुना टी-चाचणी वापरून, असमान भिन्नता गृहीत धरून निर्धारित केले गेले.तुलनात्मक डेटाच्या प्रत्येक जोडीसाठी दोन-पुच्छ t-चाचणी p-मूल्ये तारकांसोबत दर्शविली जातात (* p-value > 0.01, ** p-value > 0.001, *** p-value > 0.0001, **** p-value > 0.00001), ns नगण्यता दर्शवते (p-मूल्य > 0.05).अचूक p मूल्ये पुरवणी तक्ता 1 मध्ये दिली आहेत आणि मूळ डेटा कच्चा डेटा फाइल्स म्हणून सादर केला आहे.
स्पेकल्स/एग्रीगेट्सचे अमायलोइड-सदृश स्वरूप आणखी दाखवण्यासाठी, आम्ही (1 एम) NaCl च्या उच्च सांद्रतेसह 24 तास अस्पष्ट कोसरवेट नमुने हाताळले, ज्यामुळे प्रथिने कोसर्व्हेट्सपासून समुच्चय वेगळे केले गेले.जेव्हा अणुशक्ती मायक्रोस्कोपी (AFM) वापरून पृथक समुच्चय (म्हणजे, समुच्चयांचे विखुरलेले द्रावण) पाहण्यात आले, तेव्हा आम्ही सुमारे 15 एनएमच्या नियमित उंचीसह प्रामुख्याने गोलाकार आकारविज्ञानाचे निरीक्षण केले, जे उच्च मीठ एकाग्रतेच्या परिस्थितीत संबद्ध होते. पृष्ठभागावरील मजबूत हायड्रोफोबिक प्रभावामुळे सामान्य अमायलोइड फायब्रिल्सचे वर्तन (लक्षात ठेवा की फायब्रिल्सची उंची सामान्यत: ~10 एनएम असते) (पूरक अंजीर 10a).विशेष म्हणजे, मानक ThT फ्लूरोसेन्स परिक्षणामध्ये जेव्हा पृथक समुच्चयांना ThT सह उष्मायन केले गेले तेव्हा, आम्ही ThT फ्लूरोसेन्स क्वांटम उत्पन्नामध्ये नाट्यमय वाढ पाहिली, जे डाई ठराविक αS amyloid fibrils (पूरक F10b) सह उष्मायन करताना आढळलेल्या तुलनेत दिसून येते. coacervate समुच्चयांमध्ये amyloid सारखी रचना असते..खरं तर, एकूण उच्च मीठ सांद्रता सहनशील होते परंतु 4 M guanidine क्लोराईड (GdnHCl) ला संवेदनशील होते, जसे की विशिष्ट अमायलोइड फायब्रिल्स (पूरक अंजीर 10c).
पुढे, आम्ही सिंगल मॉलिक्युल फ्लूरोसेन्स, स्पेसिफिक फ्लूरोसेन्स कॉरिलेशन/क्रॉस-कॉरिलेशन स्पेक्ट्रोस्कोपी (FCS/FCCS) आणि टू-कलर कॉइनिडेंस डिटेक्शन (TCCD) च्या बर्स्ट विश्लेषणाचा वापर करून समुच्चयांच्या रचनेचे विश्लेषण केले.यासाठी, आम्ही αS आणि Tau441 (दोन्ही 25 μM) 1 μM AF488-लेबल αS आणि 1 μM Atto647N-लेबल केलेले Tau441 सह 100 μl LLPS नमुन्यांमध्ये उष्मायनाच्या 24 तासांनंतर तयार केलेले एकत्रित वेगळे केले.LLPS आणि प्रथिने यांच्यातील कोणतेही संभाव्य इलेक्ट्रोस्टॅटिक परस्परसंवाद टाळण्यासाठी समान PEG-मुक्त बफर आणि 1 M NaCl (कोसेर्व्हेटपासून एकत्रित विभक्त करण्यासाठी वापरलेला समान बफर) वापरून परिणामी विखुरलेले एकूण द्रावण एका मोनोमोलेक्युलर अवस्थेत पातळ करा.एका रेणूच्या वेळेच्या प्रक्षेपणाचे उदाहरण चित्र 7a मध्ये पाहिले जाऊ शकते.FCCS/FCS विश्लेषण (क्रॉस-कॉरिलेशन, CC आणि ऑटोकॉरिलेशन, AC) ने दाखवले की αS आणि tau असलेले एकुण नमुन्यांमध्ये मुबलक प्रमाणात होते (चित्र 7b मध्ये CC वक्र पहा, डाव्या पॅनेलमध्ये), आणि अवशिष्ट मोनोमेरिक प्रोटीनचा अतिरिक्त प्रमाण म्हणून उद्भवला. डायल्युशन प्रक्रियेचा परिणाम (आकृती 7b मधील AC वक्र, डावीकडील पॅनेल पहा).फक्त मोनोमेरिक प्रथिने असलेल्या नमुन्यांचा वापर करून समान सोल्यूशन परिस्थितीत केलेल्या नियंत्रण प्रयोगांमध्ये कोणतेही सीसी वक्र दिसले नाहीत आणि AC वक्र एक-घटक प्रसार मॉडेल (Eq. 4) मध्ये चांगले बसतात, जेथे मोनोमेरिक प्रथिनांमध्ये अपेक्षित प्रसार गुणांक असतात (चित्र 7b). ), उजवे पॅनेल).एकत्रित कणांचे प्रसरण गुणांक 1 µm2/s पेक्षा कमी आहे आणि मोनोमेरिक प्रथिनांचे सुमारे 1 µm2/s आहे.50-100 µm/s;मूल्ये सोनिकेटेड αS amyloid fibrils आणि monomeric αS साठी पूर्वी प्रकाशित केलेल्या मूल्यांप्रमाणेच समान समाधान परिस्थितींमध्ये स्वतंत्रपणे आहेत44.जेव्हा आम्ही TCCD स्फोट विश्लेषण (Fig. 7c, शीर्ष पॅनेल) सह समुच्चयांचे विश्लेषण केले, तेव्हा आम्हाला आढळले की प्रत्येक पृथक एकूणात (αS/Tau heteroaggregate), सुमारे 60% आढळलेल्या समुच्चयांमध्ये αS आणि tau दोन्ही समाविष्ट आहेत, सुमारे 30% फक्त समाविष्ट आहेत tau, फक्त 10% αS.αS/Tau heteroaggregates च्या Stoichiometric विश्लेषणात असे दिसून आले की बहुतेक heteroaggregates Tau मध्ये समृद्ध होते (stoichiometry 0.5 पेक्षा कमी, प्रत्येक एकूण tau रेणूंची सरासरी संख्या αS रेणूंपेक्षा 4 पट जास्त आहे), जे आमच्या FLIM मध्ये निरीक्षण केलेल्या कामाशी सुसंगत आहे. प्रयोग.FRET विश्लेषणात असे दिसून आले की या समुच्चयांमध्ये दोन्ही प्रथिने आहेत, जरी या प्रकरणात वास्तविक FRET मूल्ये फार महत्त्वाची नसतात, कारण प्रयोगात वापरलेल्या लेबल न केलेल्या प्रथिनांच्या जास्तीमुळे प्रत्येक एकूणात फ्लोरोफोर्सचे वितरण यादृच्छिक होते.विशेष म्हणजे, जेव्हा आम्ही 45,46 परिपक्व अमायलोइड एकत्रीकरण-कमतरता टाऊ प्रकार वापरून तेच विश्लेषण केले (पूरक आकृती 11a,b पहा), आमच्या लक्षात आले की αS इलेक्ट्रोस्टॅटिक एकत्रीकरण समान असले तरी (पूरक आकृती 11c, d), कोसर्व्हेटमध्ये एकत्रित तयार करण्याची क्षमता मोठ्या प्रमाणात कमी झाली आणि FLIM ला सिटू प्रयोगांमध्ये अनेक स्पॉट्स आढळले आणि वेगळ्या एकत्रित नमुन्यांसाठी कमकुवत क्रॉस-संबंध वक्र दिसून आले.तथापि, आढळलेल्या समुच्चयांच्या थोड्या संख्येसाठी (Tau441 चा फक्त एक दशांश), आम्ही असे निरीक्षण केले की प्रत्येक एकुण या Tau प्रकारापेक्षा αS मध्ये समृद्ध होते, जवळपास 50% आढळलेल्या एकूणात केवळ αS रेणू असतात आणि αS जास्त प्रमाणात विषम होते. .Tau441 (Fig. 6f) द्वारे व्युत्पन्न केलेल्या विषम समुच्चयांच्या उलट (पूरक चित्र 11e पहा).या प्रयोगांच्या परिणामांवरून असे दिसून आले की जरी αS स्वतःच coacervate मध्ये tau बरोबर जमा होण्यास सक्षम आहे, तरी tau nucleation या परिस्थितीत अधिक अनुकूल आहे आणि परिणामी amyloid सारखी समुच्चय αS आणि tau चे स्वरूप म्हणून कार्य करण्यास सक्षम आहेत.तथापि, एकदा टाऊ-समृद्ध गाभा तयार झाल्यावर, αS आणि tau मधील विषमता परस्परसंवादांना tau रेणूंमधील होमोटाइपिक परस्परसंवादापेक्षा एकत्रितपणे अनुकूल केले जाते;आम्ही द्रव αS/tau coacervates मध्ये प्रथिने नेटवर्क देखील पाहतो.
αS/Tau441 इलेक्ट्रोस्टॅटिक कोसेर्व्हेट्समध्ये तयार झालेल्या पृथक समुच्चयांचे एकल रेणूंचे प्रतिनिधी प्रतिदीप्ति टेम्पोरल ट्रेस.αS/Tau441 coaggregates (निर्देशित थ्रेशोल्डच्या वरचे स्फोट) शी संबंधित स्फोट तीन शोध वाहिन्यांमध्ये आढळून आले (प्रत्यक्ष उत्तेजनानंतर AF488 आणि Atto647N उत्सर्जन, निळ्या आणि लाल रेषा, अप्रत्यक्ष उत्तेजनानंतर Atto647N उत्सर्जन), FRET, व्हायलेट लाइन).b FCS/FCCS विश्लेषण LLPS (डावीकडे पॅनेल) वरून प्राप्त केलेल्या पृथक αS/Tau441 समुच्चयांच्या नमुन्याचे.AF488 आणि Atto647N साठी ऑटोकॉरिलेशन (AC) वक्र अनुक्रमे निळ्या आणि लाल रंगात दाखवले आहेत आणि दोन्ही रंग असलेल्या समुच्चयांशी संबंधित क्रॉस-कॉरिलेशन (CC) वक्र जांभळ्या रंगात दाखवले आहेत.AC वक्र लेबल केलेल्या मोनोमेरिक आणि एकत्रित प्रोटीन प्रजातींची उपस्थिती दर्शवतात, तर CC वक्र केवळ दुहेरी-लेबल केलेल्या समुच्चयांचा प्रसार दर्शवतात.समान विश्लेषण, परंतु वेगळ्या स्थळांप्रमाणेच समाधानाच्या परिस्थितीत, फक्त मोनोमेरिक αS आणि Tau441 असलेले नमुने उजव्या पॅनेलमध्ये नियंत्रणे म्हणून दाखवले जातात.c αS/Tau441 इलेक्ट्रोस्टॅटिक कोसेर्व्हेट्समध्ये तयार झालेल्या पृथक समुच्चयांच्या एकल रेणूंचे फ्लूरोसेन्स फ्लॅश विश्लेषण.चार वेगवेगळ्या पुनरावृत्तीमध्ये आढळलेल्या प्रत्येक एकूण माहितीची माहिती त्यांच्या स्टोइचियोमेट्री, S मूल्ये आणि FRET कार्यक्षमता (शीर्ष पॅनेल, रंग पट्टी घटना प्रतिबिंबित करते) यांच्या विरूद्ध प्लॉट केली जाते.तीन प्रकारचे समुच्चय वेगळे केले जाऊ शकतात: S~1 आणि FRET~0 सह -αS-केवळ समुच्चय, S~0 आणि FRET~1 सह केवळ Tau-एकत्रित, आणि मध्यवर्ती S सह विषम Tau/αS एकत्रित आणि रकमेचे FRET अंदाज प्रत्येक विषम समुच्चय (N = 100) मध्ये आढळलेल्या दोन्ही मार्कर प्रथिने खालच्या पॅनेलमध्ये दर्शविल्या जातात (रंग स्केल घटना प्रतिबिंबित करते).कच्चा डेटा रॉ डेटा फाइल्सच्या स्वरूपात प्रदान केला जातो.
द्रव प्रथिनांची परिपक्वता किंवा वृद्धत्व कालांतराने जेल सारखी किंवा घन संरचनांमध्ये घनरूप होणे कंडेन्सेट 47 च्या अनेक शारीरिक कार्यांमध्ये तसेच रोगामध्ये सामील असल्याचे नोंदवले गेले आहे, एक असामान्य प्रक्रिया आहे जी अमायलोइड एकत्रीकरण 7, 48, 49 पूर्वीची आहे. येथे आम्ही फेज वेगळे करणे आणि वर्तनाचा तपशीलवार अभ्यास करतो.LSPT αS कमी मायक्रोमोलर सांद्रता आणि शारीरिकदृष्ट्या संबंधित परिस्थितींमध्ये नियंत्रित वातावरणात यादृच्छिक पॉलीकेशन्सच्या उपस्थितीत (लक्षात घ्या की αS ची गणना केलेली शारीरिक एकाग्रता >1 µM50 आहे), LPS च्या विशिष्ट थर्मोडायनामिकली चालित वर्तनानंतर.आम्हाला आढळले की αS, ज्यामध्ये फिजियोलॉजिकल pH वर अत्यंत नकारात्मक चार्ज असलेले C-टर्मिनल क्षेत्र आहे, ते इलेक्ट्रोस्टॅटिक प्रक्रियेद्वारे pLK किंवा Tau सारख्या अत्यंत कॅशनिक डिसऑर्डर पेप्टाइड्सच्या उपस्थितीत LLPS द्वारे जलीय द्रावणात प्रथिनेयुक्त थेंब तयार करण्यास सक्षम आहे. एकत्रित macromolecules च्या उपस्थितीत जटिल संक्षेपण.या प्रक्रियेचा सेल्युलर वातावरणात संबंधित प्रभाव असू शकतो जेथे αS विट्रो आणि vivo51,52,53,54 मध्ये त्याच्या रोग-संबंधित एकत्रीकरणाशी संबंधित विविध पॉलीकेशनिक रेणूंचा सामना करतो.
बर्‍याच अभ्यासांमध्ये, थेंबांमधील प्रथिने गतिशीलता परिपक्वता प्रक्रिया 55,56 निर्धारित करणार्‍या प्रमुख घटकांपैकी एक मानली गेली आहे.इलेक्ट्रोस्टॅटिक αS पॉलीकेशन्ससह कोसर्व्हेट करते, परिपक्वता प्रक्रिया स्पष्टपणे पॉलीकेशन्ससह परस्परसंवादाच्या सामर्थ्यावर, व्हॅलेन्स आणि या परस्परसंवादांच्या बहुविधतेवर अवलंबून असते.समतोल सिद्धांत असे सुचवितो की दोन द्रव अवस्थेतील समतोल लँडस्केप म्हणजे LLPS57,58 चालविणाऱ्या बायोपॉलिमरमध्ये समृद्ध असलेल्या मोठ्या थेंबाची उपस्थिती असेल.ओस्टवाल्ड मॅच्युरेशन 59, कोलेसेन्स 60 किंवा विखुरलेल्या फेज 61 मध्ये फ्री मोनोमरच्या वापराद्वारे थेंबाची वाढ साध्य करता येते.αS आणि Tau441, ΔNt-Tau किंवा pLK साठी, बहुतेक प्रथिने या अभ्यासात वापरलेल्या परिस्थितीनुसार कंडेन्सेटमध्ये केंद्रित होते.तथापि, पृष्ठभाग ओले झाल्यावर पूर्ण-आकाराचे टाऊ थेंब वेगाने एकत्र होत असताना, थेंब एकत्र करणे आणि ओले करणे ΔNt-Tau आणि pLK साठी कठीण होते, जे या दोन प्रणालींमधील द्रव गुणधर्मांचे जलद नुकसान सूचित करते.आमच्या FLIM-FRET विश्लेषणानुसार, वृद्ध pLK आणि ΔNt-Tau थेंबांनी मूळ थेंबांप्रमाणेच प्रथिने एकत्रीकरण (समान फ्लूरोसेन्स लाइफटाईम) दर्शविले, जे सूचित करते की मूळ प्रथिने नेटवर्क अधिक कठोर असले तरी ते कायम ठेवण्यात आले होते.
आम्ही आमचे प्रायोगिक परिणाम खालील मॉडेलमध्ये तर्कसंगत करतो (आकृती 8).सुरुवातीला तात्पुरते तयार झालेले थेंब बहुधा इलेक्ट्रोस्टॅटिक भरपाईशिवाय प्रोटीन नेटवर्क असतात आणि अशा प्रकारे चार्ज असमतोलाचे क्षेत्र असतात, विशेषत: ड्रॉपलेट इंटरफेसमध्ये, परिणामी उच्च इलेक्ट्रोस्टॅटिक पृष्ठभाग क्षमता असलेले थेंब बनतात.चार्जची भरपाई करण्यासाठी (सामान्यत: व्हॅलेन्स कमी होणे म्हणून ओळखली जाणारी घटना) आणि थेंबांच्या पृष्ठभागाची क्षमता कमी करण्यासाठी, थेंबांमध्ये सौम्य टप्प्यातील नवीन पॉलीपेप्टाइड्स समाविष्ट होऊ शकतात, चार्ज-चार्ज परस्परसंवाद ऑप्टिमाइझ करण्यासाठी प्रोटीन नेटवर्कची पुनर्रचना करू शकतात आणि इतर थेंबांशी संवाद साधू शकतात.पृष्ठभागांसह (ओले करणे).αS/pLK थेंब, त्यांच्या सोप्या प्रथिने नेटवर्कमुळे (केवळ αS आणि pLK मधील विषमता) आणि प्रथिने-प्रोटीन परस्परसंवादासाठी अधिक आत्मीयतेमुळे, कंडेन्सेटच्या चार्जमध्ये अधिक वेगाने समतोल साधण्यात सक्षम असल्याचे दिसते;खरंच, आम्ही αS/Tau पेक्षा सुरुवातीला तयार झालेल्या αS/pLK कोसर्व्हेट्समध्ये जलद प्रथिने गतिशास्त्राचे निरीक्षण केले.व्हॅलेन्स कमी झाल्यानंतर, संवाद कमी तात्पुरते होतात आणि थेंब त्यांचे द्रव गुणधर्म गमावतात आणि कमी इलेक्ट्रोस्टॅटिक पृष्ठभागाच्या संभाव्यतेसह (आणि त्यामुळे पृष्ठभाग ओले करू शकत नाहीत) जेलसारखे, ज्वलनशील नसलेल्या थेंबांमध्ये बदलतात.याउलट, αS/Tau droplets अधिक जटिल प्रोटीन नेटवर्क्स (होमोटाइपिक आणि हेटरोटाइपिक दोन्ही परस्परसंवादांसह) आणि प्रथिने परस्परसंवादाच्या कमकुवत स्वरूपामुळे ड्रॉपलेट चार्ज बॅलन्स ऑप्टिमाइझ करण्यात कमी कार्यक्षम आहेत.याचा परिणाम थेंबांमध्ये होतो जे दीर्घ कालावधीसाठी द्रव वर्तन टिकवून ठेवतात आणि उच्च इलेक्ट्रोस्टॅटिक पृष्ठभागाची क्षमता प्रदर्शित करतात जी एकत्र करून आणि वाढवून (अशा प्रकारे थेंबांच्या पृष्ठभागाचे क्षेत्रफळ/व्हॉल्यूम प्रमाण कमी करून) आणि हायड्रोफिलिक पृष्ठभाग रसायन ओले करून कमी केली जाते.हे मोठ्या प्रमाणात केंद्रित प्रोटीन लायब्ररी तयार करते जे द्रव गुणधर्म राखून ठेवते कारण प्रथिने नेटवर्कमध्ये चार्ज ऑप्टिमायझेशनच्या सतत शोधामुळे परस्परसंवाद खूप क्षणिक राहतात.विशेष म्हणजे, काही नैसर्गिकरित्या उद्भवणाऱ्या isoforms62 सह टाऊचे N-टर्मिनली कापलेले प्रकार, मध्यवर्ती वर्तन प्रदर्शित करतात, काही αS सह वृद्धत्व असलेल्या दीर्घकालीन जेल सारख्या थेंबामध्ये बदलतात, तर काही मोठ्या द्रव कंडेन्सेटमध्ये बदलतात.αS इलेक्ट्रोस्टॅटिक कोसेर्व्हेट्सच्या परिपक्वतामधील हे द्वैत अलीकडील LLPS सैद्धांतिक आणि प्रायोगिक अभ्यासांशी सुसंगत आहे ज्यात कंडेन्सेट आकार आणि द्रव गुणधर्म नियंत्रित करण्यासाठी कंडेन्सेटमध्ये व्हॅलेन्स कमी होणे आणि इलेक्ट्रोस्टॅटिक सिव्हिंग यांच्यातील परस्परसंबंध ओळखले गेले आहे.यंत्रणा 58.61.
ही योजना LLPS आणि LSPT द्वारे αS आणि Tau441 साठी पुटेटिव्ह अमायलोइड एकत्रीकरण मार्ग दर्शवते.अतिरिक्त आयन-समृद्ध (लाल) आणि केशन-समृद्ध (निळा) प्रदेशांसह, समाधानकारक व्हॅलेन्ससह αS आणि ताऊ इलेक्ट्रोस्टॅटिक कोसर्वेट्समध्ये पृष्ठभागाची उर्जा कमी असते आणि त्यामुळे कमी संयोग होतो, परिणामी थेंबाचे वृद्धत्व जलद होते.एक स्थिर नॉन-एग्लोमेरेटेड जेल स्थिती प्राप्त होते..αS/pLK प्रणालीच्या बाबतीत ही परिस्थिती त्याच्या उच्च आत्मीयतेमुळे आणि सोप्या प्रोटीन-जोडी परस्परसंवाद नेटवर्कमुळे खूप अनुकूल आहे, जे जलद जेल-सारखे संक्रमण करण्यास अनुमती देते.याउलट, असमाधानकारक व्हॅलेन्स असलेले थेंब आणि त्यामुळे, परस्परसंवादासाठी उपलब्ध प्रथिने-चार्ज केलेले क्षेत्र, कोसर्व्हेटला हायड्रोफिलिक पृष्ठभागावर फ्यूज करणे आणि ओले करणे सोपे करते जेणेकरून पृष्ठभागाची उच्च ऊर्जा कमी होईल.ही परिस्थिती αS/Tau441 coacervates साठी श्रेयस्कर आहे, ज्यात कमकुवत Tau-Tau आणि αS-Tau परस्परसंवाद असलेले मल्टीव्हॅलेंट कॉम्प्लेक्स नेटवर्क आहे.या बदल्यात, मोठे कोसरवेट्स अधिक सहजतेने त्यांचे द्रवासारखे गुणधर्म टिकवून ठेवतील, ज्यामुळे इतर प्रथिने-ते-प्रथिने परस्परसंवाद घडू शकतात.अखेरीस, कोसरव्हेट द्रवपदार्थामध्ये αS आणि tau दोन्ही असलेले अमायलोइड विषम समुच्चय तयार होतात, जे समावेश शरीरात आढळणाऱ्यांशी संबंधित असू शकतात, जे न्यूरोडीजनरेटिव्ह रोगांचे वैशिष्ट्य आहेत.
αS/Tau441 च्या परिपक्वता दरम्यान तयार झालेल्या मोठ्या द्रव-सदृश संरचना अत्यंत गर्दीच्या परंतु गतिमान प्रथिन वातावरणासह आणि थोड्या प्रमाणात, αS/ΔNt-Tau coacervates हे प्रथिने एकत्रीकरणाच्या केंद्रीकरणासाठी आदर्श जलाशय आहेत.या प्रकारच्या प्रथिने कोसरवेट्समध्ये घन प्रथिनांच्या एकत्रित निर्मितीचे आम्ही खरोखर निरीक्षण केले आहे, ज्यामध्ये अनेकदा αS आणि tau दोन्ही असतात.आम्ही दर्शविले आहे की हे हेटरोएग्रीगेट्स नॉन-इलेक्ट्रोस्टॅटिक परस्परसंवादाद्वारे स्थिर आहेत, विशिष्ट अमायलोइड फायब्रिल्स प्रमाणेच अमायलोइड-विशिष्ट ThT रंग बांधण्यास सक्षम आहेत आणि खरंच विविध प्रभावांना समान प्रतिकार आहेत.LLPS द्वारे तयार केलेल्या αS/tau समुच्चयांमध्ये amyloid सारखे गुणधर्म असल्याचे दर्शविले गेले.खरंच, द्रव इलेक्ट्रोस्टॅटिक कोसर्वेटमध्ये या विषम αS समुच्चयांच्या निर्मितीमध्ये amyloid एकत्रीकरणामध्ये Tau च्या कमतरतेचा परिपक्व प्रकार लक्षणीयरीत्या बिघडला आहे.αS/Tau441 समुच्चयांची निर्मिती फक्त coacervates मध्येच आढळून आली, ज्याने द्रव सारखे गुणधर्म टिकवून ठेवले आणि जर coacervates/droplets जेल अवस्थेपर्यंत पोहोचले नाहीत तर कधीही नाही.नंतरच्या प्रकरणात, इलेक्ट्रोस्टॅटिक परस्परसंवादाची वाढलेली ताकद आणि परिणामी, प्रथिने नेटवर्कची कडकपणा, अमायलोइड न्यूक्लिएशनसाठी आवश्यक नवीन प्रथिने परस्परसंवाद स्थापित करण्यासाठी प्रथिनांच्या आवश्यक संरचनात्मक पुनर्रचनांना प्रतिबंधित करते.तथापि, हे अधिक लवचिक, द्रव-सदृश कोसरवेट्समध्ये प्राप्त केले जाऊ शकते, जे आकारात वाढल्यामुळे द्रव राहण्याची अधिक शक्यता असते.
घनीभूत अवस्थेमध्ये एकत्रित तयार होणे हे लहान थेंबांपेक्षा मोठ्या αS/Tau कंडेन्सेट्समध्ये श्रेयस्कर आहे जे वेगाने जेल बनवते, हे तथ्य ठळक करते की थेंब एकत्रीकरण नियंत्रित करणारे घटक ओळखण्याची प्रासंगिकता.अशाप्रकारे, केवळ फेज वेगळे करण्याची प्रवृत्ती नाही, तर कंडेन्सेटचा आकार योग्य कार्यासाठी तसेच रोग प्रतिबंधक 58,61 नियंत्रित करणे आवश्यक आहे.आमचे परिणाम αS/Tau सिस्टीमसाठी LLPS आणि LSPT मधील संतुलनाचे महत्त्व देखील अधोरेखित करतात.संपृक्ततेच्या परिस्थितीत उपलब्ध प्रोटीन मोनोमर्सचे प्रमाण कमी करून थेंबाची निर्मिती अमायलोइड एकत्रीकरणापासून संरक्षण करू शकते, जसे की इतर प्रणालींमध्ये प्रस्तावित केले आहे63,64, उच्च थेंब स्तरांवर ड्रॉपलेट फ्यूजन मंद संरचनात्मक पुनर्रचनांद्वारे अंतर्गत प्रोटीन एकत्रीकरणास कारणीभूत ठरू शकते.प्रथिने नेटवर्क..
एकंदरीत, आमचा डेटा LSPT च्या संदर्भात ड्रॉप नेटवर्क्समधील एकसंध व्हॅलेन्स आणि समाधानी/असंतुष्ट परस्परसंवादाच्या प्रासंगिकतेवर जोर देतो.विशेषतः, आम्ही दाखवतो की पूर्ण-लांबीचे αS/Tau441 कंडेन्सेट कार्यक्षमतेने फ्यूज आणि अ‍ॅमिलॉइड-सदृश हेटरोएग्रीगेट्स तयार करण्यास सक्षम आहेत ज्यात दोन्ही प्रथिने समाविष्ट आहेत आणि आमच्या प्रायोगिक परिणामांवर आधारित आण्विक यंत्रणा प्रस्तावित करते.αS/Tau fluid coacervate मधील दोन प्रथिनांचे सह-एकत्रीकरण, ज्याचा आम्ही येथे अहवाल देत आहोत, ते खरंच समावेशातील दोन प्रथिनांच्या सह-स्थानिकीकरणाशी संबंधित असू शकतात, जे रोगाचे वैशिष्ट्य आहेत आणि LLPS आणि अ‍ॅमिलॉइड एकत्रीकरण, न्यूरोडीजनरेशनमध्ये उच्च चार्ज आयडीपीसाठी मार्ग प्रशस्त करते.
मोनोमेरिक WT-αS, cysteine ​​mutants (Q24C-αS, N122C-αS) आणि ΔCt-αS रूपे (Δ101-140) E. coli मध्ये व्यक्त केले गेले आणि पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे शुद्ध केले गेले.डायसल्फाइड बाँड तयार होण्यापासून रोखण्यासाठी αS सिस्टीन म्युटंट्सच्या शुध्दीकरणाच्या सर्व चरणांमध्ये 5 mM DTT समाविष्ट केले गेले.Tau441 isoform (Adgene #16316 वरून मिळवलेले प्लाझमिड), ΔNt-Tau प्रकार (Δ1–150, प्राइमर्ससह IVA क्लोनिंग करून प्राप्त केलेले CTTTAAGAAGGAGAGAATACATGATCGCCCACCGCGG, CATATGTATCCTCTCTTCTTATAAGTTAA53, ΔTAAGTTAA पुरूष-150-5-150 प्राइमर) GGCTC5 प्राइमरसह) ई. कोलाय कल्चर होते 37°C आणि 180 rpm वर OD600 = 0.6–0.7 पर्यंत वाढले आणि 37°C वर 3 तास IPTG सह अभिव्यक्ती प्रेरित झाली.11,500 xg वर 15 मिनिटांसाठी 4°C वर पेशी काढा आणि 150 mM NaCl असलेल्या सलाईन बफरने धुवा.पेलेटला लिसिस बफरमध्ये पुन्हा लावा (20 मिली प्रति 1 एल एलबी: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine, 50 μpeμpinM 50ptinM).10 डाळींसाठी (1 मिनिट चालू, 1 मिनिट बंद) साठी 80% च्या मोठेपणासह सॉनिकेशन चरण बर्फावर केले गेले.एका अल्ट्रासाऊंडमध्ये 60 मिली पेक्षा जास्त नसावे.E. coli lysates 95° C वर 20 मिनिटांसाठी गरम केले गेले, नंतर बर्फावर थंड केले आणि 40 मिनिटांसाठी 127,000×g वर सेंट्रीफ्यूज केले.स्पष्टीकरण केलेले सुपरनॅटंट 3.5 kDa झिल्ली (स्पेक्ट्रम™ थर्मो फिशर सायंटिफिक, यूके) वर लागू केले गेले आणि 4 एल डायलिसिस बफर (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 m2 m2 mM) विरुद्ध डायलायझ केले गेले. , PMSF 0.1 mM) 10 तासांसाठी.एक 5 मिली कॅशन एक्सचेंज कॉलम (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) समतोल बफर (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, PTM 0) समतोल करण्यात आला.Tau lysate 0.22 μm PVDF फिल्टरद्वारे फिल्टर केले गेले आणि 1 ml/min च्या प्रवाह दराने स्तंभात इंजेक्ट केले गेले.इल्युशन हळूहळू केले गेले, टाऊ 15-30% इल्यूशन बफर (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF) सह इल्युट केले गेले.SDS-PAGE द्वारे अपूर्णांकांचे विश्लेषण केले गेले आणि टाऊच्या अपेक्षित आण्विक वजनासह एक बँड असलेले कोणतेही अपूर्णांक 10 kDa सेंट्रीफ्यूज फिल्टर वापरून केंद्रित केले गेले आणि 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM आणि DTT mM असलेल्या बफरने बदलले. अंतिम प्रोटीन एकाग्रता 100 μM होती.प्रथिने द्रावण नंतर 0.22 μm PVDF फिल्टरमधून पार केले गेले, त्वरीत गोठवले गेले आणि -80°C वर साठवले गेले.प्रो. अल्बर्टो बोफी यांनी प्रथिने K18 दयाळूपणे प्रदान केली होती.SDS-PAGE आणि MALDI-TOF/TOF द्वारे पुष्टी केल्यानुसार तयारीची शुद्धता >95% होती.विविध सिस्टीनवर रासायनिक लेबले AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) किंवा TEMPOL-maleimide (टोरंटो रिसर्च केमिकल्स, टोरोंटो, कॅनडा) असे होते.शोषक आणि MALDI-TOF/TOF द्वारे पुष्टी केली गेली.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau आणि K18 ला 191 आणि 322 स्थानांवर मूळ सिस्टीन अवशेषांसह लेबल केले गेले होते Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, जर्मनी) वापरून त्याच प्रक्रियेचे अनुसरण केले.CIDER66 वापरून αS आणि Tau441 साठी प्रति अवशेष नकाशे निव्वळ शुल्क व्युत्पन्न केले गेले.
सॉलिड पॉली-एल-लाइसिन (पुरवठादार, अलामांडा पॉलिमर्स इंक, हंट्सविले, अलाबामा, यूएसए कडून NMR नुसार pLK DP 90-110) हे 10 मिमी HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 ते 10 mM एकाग्रतेमध्ये विरघळले होते, प्रक्रियेसाठी sonicated अल्ट्रासोनिक वॉटर बाथमध्ये मिनिटे आणि -20 डिग्री सेल्सिअस तापमानात साठवा.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) आणि FITC-dextran-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, USA) हे पाण्यात विरघळणारे आहेत आणि LLPS बफरमध्ये मोठ्या प्रमाणात वितरीत केले जातात.डायलिसिस दूषित लवण काढून टाकते.त्यानंतर ते 0.22 μm च्या छिद्र आकारासह सिरिंज फिल्टरद्वारे फिल्टर केले गेले आणि त्यांची एकाग्रता रीफ्रॅक्टोमीटर (मेटलर टोलेडो, कोलंबस, ओहायो, यूएसए) वापरून मोजली गेली.LLPS नमुने खोलीच्या तपमानावर खालील क्रमाने तयार केले गेले: बफर आणि एक्सट्रूझन मिसळले गेले आणि 1 मिमी ट्रिस (2-कार्बोक्झिथिल) फॉस्फिन (TCEP, कार्बोसिंथ, कॉम्प्टन, यूके), 1 मिमी 2,2,2,2- (इथेन- 1, 2-diyldinitrile) टेट्रासेटिक ऍसिड (EDTA, carboxynth) आणि 1% प्रोटीज इनहिबिटर (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM) यांचे मिश्रण.नंतर αS आणि फ्यूज केलेले पॉलीकेशन (पर्याय pLK किंवा Tau) जोडले जातात.थिओफ्लेविन-टी टाइम सीरीज प्रयोगांसाठी (ThT, Carbosynth, Compton, UK), एकूण ThT एकाग्रता αS एकाग्रतेच्या निम्म्यासाठी वापरा.नमुने एकसंध असल्याचे सुनिश्चित करण्यासाठी हळूवारपणे परंतु पूर्णपणे मिसळा.परिणाम विभागात वर्णन केल्याप्रमाणे, प्रत्येक घटकाची एकाग्रता प्रयोगानुसार भिन्न असते.जेव्हा प्रयोगाचा कालावधी 4 तासांपेक्षा जास्त असेल तेव्हा अझाइडचा वापर 0.02% (w/v) च्या एकाग्रतेवर केला गेला.LLPS नमुने वापरून सर्व विश्लेषणांसाठी, विश्लेषणापूर्वी 5 मिनिटे मिश्रण समतोल होऊ द्या.लाइट स्कॅटरिंग विश्लेषणासाठी, 150 μl नमुने नॉन-बाइंडिंग 96-वेल मायक्रोप्लेट्स (µClear®, ब्लॅक, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) वर लोड केले गेले आणि चिकट फिल्मने झाकले गेले.CLARIOstar प्लेट रीडर (BMG Labtech, Ortenberg, Germany) मध्ये द्रावणाच्या मध्यभागी 350 nm शोषकता मोजून LLP चे परीक्षण केले गेले.प्रयोग 25°C वर त्रिगुणात केले गेले आणि त्रुटींची गणना सरासरीपासून मानक विचलन म्हणून केली गेली.सौम्य टप्प्याचे प्रमाण सॅम्पल सेंट्रीफ्यूगेशन आणि SDS-PAGE जेल विश्लेषणाद्वारे निश्चित केले गेले आणि विविध LLPS सोल्यूशनमध्ये सौम्य आणि केंद्रित टप्प्यांमधील αS अंशाचे प्रमाण निश्चित केले गेले.1 μM AF488-लेबल असलेला αS असलेला 100 μl LLPS नमुना 30 मिनिटांसाठी 9600×g वर सेंट्रीफ्यूगेशन नंतर पूर्ण मिक्सिंगद्वारे तयार केला गेला, ज्यानंतर प्रक्षेपण सामान्यतः दृश्यमान होते.SDS-PAGE जेल वापरून प्रथिने प्रमाणीकरणासाठी सुपरनॅटंटचे शीर्ष 50 μl वापरले गेले.केमीडॉक जेल इमेजिंग सिस्टम (बायो-रॅड लॅबोरेटरीज, हरक्यूलिस, सीए, यूएसए) वापरून AF488 फिल्टरसह जेल स्कॅन केले गेले किंवा कूमासी डागांनी डागले आणि योग्य फिल्टरसह दृश्यमान केले.इमेजजे आवृत्ती 1.53i (नॅशनल इन्स्टिट्यूट ऑफ हेल्थ, यूएसए) वापरून परिणामी बँडचे विश्लेषण केले गेले.समान परिणामांसह दोन भिन्न प्रयोगांमध्ये प्रयोग डुप्लिकेटमध्ये केले गेले.
सामान्यतः, 150 μl नमुने नॉन-बाइंडिंग 96-वेल मायक्रोप्लेट्सवर लागू केले गेले आणि खोलीच्या तपमानावर Leica DMI6000B इन्व्हर्टेड मायक्रोस्कोप (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) वर दृश्यमान केले गेले.स्पॉट प्रयोगांसाठी, µ-स्लाइड अँजिओजेनेसिस प्लेट्स (Ibidi GmbH, Gräfelfing, जर्मनी) किंवा 96-वेल पॉलिस्टीरिन मायक्रोप्लेट्स (कॉर्निंग कोस्टार कॉर्पोरेशन, एक्टन, मॅसॅच्युसेट्स) देखील वापरल्या गेल्या.EL6000 हॅलोजन किंवा मर्क्युरी मेटल हॅलाइड दिवे प्रदीपन स्रोत म्हणून वापरले गेले (अनुक्रमे BF/DIC आणि WF इमेजिंगसाठी).WF मायक्रोस्कोपीसाठी, 40x मॅग्निफिकेशन एअर उद्दिष्ट (Leica Microsystems, Germany) नमुन्यावर प्रकाश केंद्रित करण्यासाठी आणि तो गोळा करण्यासाठी वापरला गेला.AF488 आणि ThT लेबल केलेल्या नमुन्यांसाठी, मानक GFP फिल्टर सेटसह उत्तेजना आणि उत्सर्जन फिल्टर करा, उत्तेजना आणि उत्सर्जन बँडपास फिल्टर, अनुक्रमे 460–500 nm आणि 512–542 nm बँडपास फिल्टर आणि 495 nm dichrod.Atto647N लेबल केलेल्या नमुन्यांसाठी, अनुक्रमे 628–40 nm आणि 692–40 nm, उत्तेजना आणि उत्सर्जन बँडपास फिल्टरसह Cy5 फिल्टरचा मानक संच आणि 660 nm डायक्रोइक मिरर वापरला गेला.BF आणि DIC मायक्रोस्कोपीसाठी, समान परावर्तित प्रकाश संकलन उद्देश वापरा.गोळा केलेला प्रकाश Leica DFC7000 CCD कॅमेरा (Leica Microsystems, Germany) वर रेकॉर्ड करण्यात आला.एक्सपोजर वेळ BF आणि DIC मायक्रोस्कोपी इमेजिंगसाठी 50 ms आणि WF मायक्रोस्कोपी इमेजिंगसाठी 20-100 ms होती.तुलनेसाठी, ThT सह सर्व प्रयोगांसाठी एक्सपोजर वेळ 100 ms होता.टाइम-लॅप्स प्रयोग ड्रॉपलेट कोलेसेन्सची कल्पना करण्यासाठी केले गेले, ज्यामध्ये अनेक मिनिटांसाठी प्रत्येक 100 ms नंतर प्रतिमा गोळा केल्या जात होत्या.इमेजजे (NIH, USA) प्रतिमा विश्लेषणासाठी वापरले गेले.समान परिणामांसह प्रयोग त्रिगुणांमध्ये केले गेले.
स्थानिकीकरण प्रयोगांसाठी, FRAP आणि 3D पुनर्रचना, ZEN 2 ब्लू एडिशन (कार्ल झीस एजी, ओबेरकोचेन, जर्मनी) वापरून Zeiss LSM 880 इन्व्हर्टेड कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपवर प्रतिमा प्राप्त केल्या गेल्या.50 μl चे नमुने µ-स्लाइड अँजिओजेनेसिस पेट्री डिशेस (Ibidi GmbH, Gröfelfing, जर्मनी) वर लागू केले गेले, ज्यावर हायड्रोफिलिक पॉलिमर (ibiTreat) उपचार केले गेले आणि 63× तेल विसर्जन उद्दिष्टात आरोहित केले गेले DIC वर).0.26 µm/पिक्सेलच्या रिझोल्यूशनसह 458 nm, 488 nm, आणि 633 nm आर्गॉन लेसर लाइन वापरून प्रतिमा संपादन केल्या गेल्या आणि 470–600 nm, 6289 nm, 6289 nm च्या उत्तेजना आणि उत्सर्जन शोध विंडोसाठी 8 µs/पिक्सेलचा एक्सपोजर वेळ. आणि 638–755 nm अनुक्रमे ThT, AF488 आणि Atto647N चे व्हिज्युअलाइझ करण्यासाठी वापरले गेले.FRAP प्रयोगांसाठी, प्रत्येक नमुन्याची टाइम-लॅप्स फोटोग्राफी 1 फ्रेम प्रति सेकंदाने नोंदवली गेली.तपमानावर समान परिणामांसह प्रयोग त्रिगुणांमध्ये केले गेले.झेन 2 ब्लू एडिशन सॉफ्टवेअर (कार्ल झीस एजी, ओबरकोचेन, जर्मनी) वापरून सर्व प्रतिमांचे विश्लेषण केले गेले.OriginPro 9.1 वापरून झेन 2 वापरून प्रतिमांमधून काढलेल्या तीव्रता/वेळ डेटामध्ये FRAP वक्र सामान्यीकृत, प्लॉट आणि फिट केले गेले.रिकव्हरी वक्र मोनो-एक्सपोनेन्शिअल मॉडेलमध्ये जोडले गेले होते ज्यामुळे आण्विक प्रसारासाठी अतिरिक्त घातांकीय टर्म मिळू शकेल.आम्ही नंतर नाममात्र ब्लीचिंग त्रिज्या वापरून D ची गणना केली आणि कांग एट अल च्या समीकरणाप्रमाणे पूर्वी निर्धारित पुनर्प्राप्ती अर्ध-आयुष्य.5 35 दाखवले.
αS चे सिंगल सिस्टीन रूपे 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) सह संश्लेषित केले गेले 24 (TEMPOL-24-αS) आणि 122 (TEMPOL-122-αS), अनुक्रमेस्पिन लेबलिंग EPR प्रयोगांसाठी, αS एकाग्रता 100 μM वर सेट केली गेली आणि PEG एकाग्रता 15% (w/v) होती.विविध एकत्रीकरण परिस्थितींसाठी, αS:pLK गुणोत्तर 1:10 होते, तर αS:ΔNt-Tau आणि αS:Tau441 गुणोत्तर 1:1 वर राखले गेले.गर्दीच्या अनुपस्थितीत बंधनकारक टायट्रेशन प्रयोगांसाठी, TEMPOL-122-αS 50 μM वर राखले गेले आणि पॉलीकेशन्स वाढत्या एकाग्रतेवर टायट्रेट केले गेले, प्रत्येक स्थिती स्वतंत्रपणे तयार केली गेली.CW-EPR मोजमाप ब्रुकर ER4118 SPT-N1 रेझोनेटरसह सुसज्ज ब्रुकर ELEXSYS E580 X-बँड स्पेक्ट्रोमीटर वापरून केले गेले जे ~9.7 GHz च्या मायक्रोवेव्ह (SHF) फ्रिक्वेन्सीवर कार्यरत होते.तापमान 25°C वर सेट केले गेले आणि द्रव नायट्रोजन क्रायोस्टॅटद्वारे नियंत्रित केले गेले.स्पेक्ट्रा असंतृप्त परिस्थितीत 4 mW च्या MW पॉवरवर, 0.1 mT च्या मॉड्युलेशन मोठेपणा आणि 100 kHz च्या मॉड्युलेशन फ्रिक्वेन्सीमध्ये प्राप्त केले गेले.Tau441 किंवा ΔNt-Tau (मूळ प्रथिने सोल्यूशनमध्ये उपस्थित) असलेल्या नमुन्यांमधील रिड्यूसिंग एजंट्सच्या अवशिष्ट एकाग्रतेमुळे नमुने आणि संभाव्य स्पिन कपातमधील स्पिन एकाग्रतामधील फरक टाळण्यासाठी स्पेक्ट्रल तीव्रता सामान्य केली गेली.Matlab®67 मध्ये लागू केलेल्या Easyspin सॉफ्टवेअर (v. 6.0.0-dev.34) वापरून केलेल्या EPR स्पेक्ट्रल मॉडेलिंगच्या परिणामी g ची दिलेली मूल्ये प्राप्त झाली.डेटा मॉडेल करण्यासाठी एक/दोन घटक आयसोट्रॉपिक मॉडेल वापरले गेले.सर्व सिग्नल्सचे सामान्यीकरण केल्यानंतर, संबंधित प्रायोगिक स्पेक्ट्रममधून प्रत्येक सिम्युलेशन वजा करून अवशेषांची गणना केली गेली.बंधनकारक टायट्रेशन विश्लेषणासाठी, सामान्यीकृत EPR स्पेक्ट्रम (IIII/III) च्या दुसऱ्या बँडच्या तिसऱ्या बँडची सापेक्ष तीव्रता αS ला पॉलीकेशन्सच्या बंधनाचे परीक्षण करण्यासाठी वापरली गेली.पृथक्करण स्थिरांक (Kd) चा अंदाज लावण्यासाठी, परिणामी वक्र n समान आणि स्वतंत्र बंधनकारक साइट गृहीत धरून अंदाजे मॉडेलमध्ये बसवले गेले.
NMR स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोग ब्रुकर निओ 800 MHz (1H) NMR स्पेक्ट्रोमीटर क्रायोप्रोब आणि Z-ग्रेडियंटने सुसज्ज वापरून केले गेले.सर्व प्रयोग 130-207 µM αS आणि 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 मध्ये αS/ΔNt-Tau आणि pLK समतुल्य वापरून केले गेले आणि 15°C वर केले गेले.NMR द्वारे LPS चे निरीक्षण करण्यासाठी, पूर्व-मिश्रित नमुन्यांमध्ये 10% PEG जोडले गेले.केमिकल शिफ्ट पेर्टर्बेशन प्लॉट (Fig. 1b) सरासरी 1H आणि 15N रासायनिक शिफ्ट दाखवते.αS 2D1H-15N HSQC स्पेक्ट्रा मागील असाइनमेंट (BMRB एंट्री #25227) च्या आधारे नियुक्त केला गेला आणि HNCA, HNCO आणि CBCAcoNH च्या 3D स्पेक्ट्राचे रेकॉर्डिंग आणि विश्लेषण करून पुष्टी केली गेली.13Cα आणि 13Cβ रासायनिक शिफ्ट्सची गणना ΔNt-Tau किंवा pLK च्या उपस्थितीत शुद्ध यादृच्छिक कॉइल कॉन्फॉर्मेशन 68 (पूरक आकृती 5c) मधील αS रासायनिक शिफ्टच्या तुलनेत दुय्यम संरचना ट्रेंडमधील संभाव्य बदल मोजण्यासाठी केली गेली.R1ρ दर 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, आणि 800 ms च्या विलंबांसह hsqctretf3gpsi प्रयोग (ब्रुकर लायब्ररीतून मिळवलेले) रेकॉर्ड करून मोजले गेले आणि घातांकीय कार्ये विलंबाच्या शिखरावर वेगवेगळ्या प्रमाणात समायोजित केली गेली. R1ρ आणि त्याची प्रायोगिक अनिश्चितता निर्धारित करण्यासाठी वेळा.
दोन-रंगीत वेळ-निराकरण केलेले फ्लूरोसेन्स मायक्रोस्कोपी प्रयोग व्यावसायिक वेळ-निराकरण केलेल्या MT200 फ्लूरोसेन्स कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपवर (पिकोक्वांट, बर्लिन, जर्मनी) वेळ-सहसंबंधित सिंगल फोटॉन मोजणी (TCSPC) उपकरणासह केले गेले.लेझर डायोड हेड स्पंदित इंटरलीव्हड एक्सिटेशन (पीआयई) साठी वापरले जाते, बीम सिंगल मोड वेव्हगाइडमधून जातो आणि डायक्रोइक मिरर नंतर मोजलेल्या 481 एनएम आणि 637 एनएम लेसर लाइनसाठी 10 ते 100 nW च्या लेसर पॉवरवर ट्यून केले जाते.हे फोटॉन अलियासिंग, फोटोब्लीचिंग आणि संपृक्ततेचे परिणाम टाळून, इष्टतम फोटॉन मोजणी दर सुनिश्चित करते.μ-स्लाइड अँजिओजेनेसिस कव्हरस्लिप्स किंवा प्लेट्स (Ibidi GmbH, Gräfelfing, जर्मनी) एका सुधारात्मक कॉलरसह (Olympus Life Sciences, Waltham, USA) सुपर अपोक्रोमॅट 60x NA 1.2 लेन्सवर थेट विसर्जन पाण्यात ठेवल्या होत्या.488/640 nm डायक्रोइक मिरर (सेमरॉक, लेक फॉरेस्ट, IL, USA) मुख्य बीम स्प्लिटर म्हणून वापरला गेला.अनफोकस्ड रेडिएशन 50 मायक्रॉन व्यासाच्या छिद्राने अवरोधित केले जाते, त्यानंतर फोकस केलेले रेडिएशन 50/50 बीम स्प्लिटरद्वारे 2 शोध पथांमध्ये विभागले जाते.बँडपास उत्सर्जन फिल्टर (सेमरॉक, लेक फॉरेस्ट, IL, USA) 520/35 हिरव्या रंगासाठी (AF488) आणि 690/70 लाल रंगासाठी (Atto647N) डिटेक्टरच्या समोर वापरले गेले.सिंगल-फोटॉन हिमस्खलन डायोड्स (SPAD) (मायक्रो फोटॉन डिव्हाइसेस, बोलझानो, इटली) डिटेक्टर म्हणून वापरले गेले.दोन्ही डेटा संकलन आणि विश्लेषण व्यावसायिकरित्या उपलब्ध SymphoTime64 सॉफ्टवेअर (PicoQuant GmbH, बर्लिन, जर्मनी) वापरून केले गेले.
एलएलपीएस नमुन्यांचे पन्नास मायक्रोलिटर μ-स्लाइड अँजिओजेनेसिस विहिरींवर (इबिडी जीएमबीएच, ग्रेफेल्फिंग, जर्मनी) लागू केले गेले.परिणामी प्रतिमा विहिरीच्या तळापासून 20 µm वर, निलंबित थेंबांसाठी इष्टतम उद्दिष्ट कार्य अंतरासाठी आणि किमान 0.25 µm/पिक्सेलच्या अक्षीय रिझोल्यूशनसह राफ्ट्स आणि डॉट्ससाठी ~1 µm आणि 400 µs/पिक्सेलच्या विलंब वेळेवर केंद्रित आहेत.प्रत्येक चॅनेलसाठी सरासरी पार्श्वभूमी सिग्नल तीव्रतेच्या (PBG, मीन + 2σ) आधारावर तीव्रता थ्रेशोल्ड लागू करून डेटा निवडा जेणेकरून विखुरलेल्या अवस्थेतून कोणतेही संभाव्य उत्पत्ती फिल्टर करून केवळ द्रव प्रोटीन थेंब, राफ्ट्स किंवा स्पॉट्स निवडले जातील.प्रत्येक चॅनेलच्या प्रत्येक प्रजातीच्या (τ) आयुर्मानाचे विश्लेषण करण्यासाठी (हिरवा, AF488 साठी “g” आणि लाल, Atto647N साठी “r”), आम्ही स्वारस्य असलेले क्षेत्र (ROI) निवडले ज्यामध्ये थेंब, तराफा किंवा डाग आहेत (पूरक आकृती 1 ).8b) आणि प्रत्येक चॅनेलमध्ये टेल-फिट विश्लेषण आणि दोन-घटक क्षय मॉडेल वापरून त्यांचे आजीवन क्षय (टिंब, तराफा किंवा स्पॉट्ससाठी अनुक्रमे τD, τR आणि τP, पूरक अंजीर पहा. 8c) फिट करून ते मिळवले.τ पासून सरासरी τ .बहु-घातांकीय फिटसाठी खूप कमी फोटॉन तयार करणारे ROI विश्लेषणातून वगळण्यात आले.वापरलेले कटऑफ राफ्ट्स आणि डॉट्ससाठी <104 फोटॉन आणि थेंबांसाठी 103 होते.थेंबांचा उंबरठा कमी असतो कारण उच्च तीव्रतेच्या मूल्यांसह क्षय वक्र मिळवणे कठीण असते, कारण प्रतिमा फील्डमधील थेंब सामान्यतः लहान आणि कमी असंख्य असतात.फोटॉन संचय मर्यादेपेक्षा जास्त फोटॉन संख्या असलेले ROI (>500 काउंट/पिक्सेल वर सेट केलेले) देखील विश्लेषणासाठी टाकून दिले.सर्व तीव्रतेच्या क्षयसाठी समान राखून किमान IRF हस्तक्षेप सुनिश्चित करण्यासाठी सेवा जीवनाच्या सुरुवातीपासून जास्तीत जास्त 90% तीव्रतेसह (किडण्याच्या कमाल तीव्रतेच्या किंचित नंतर) तीव्रतेसह स्वारस्याच्या प्रदेशातून मिळालेल्या तीव्रतेच्या क्षय वक्रशी जुळवा. सेटिंग्ज रिलेटिव्ह टाइम विंडोमध्ये राफ्ट्स आणि स्पॉट्ससाठी 25 ते 50 ROI आणि थेंबांसाठी 15-25 ROI चे विश्लेषण करण्यात आले, किमान 3 स्वतंत्र प्रयोगांमधून रेकॉर्ड केलेल्या 4 पेक्षा जास्त प्रतिकृतींमधून निवडलेल्या प्रतिमा.दोन-पुच्छ टी-चाचण्या प्रजातींमधील किंवा कोसर्व्हेट प्रणालींमधील सांख्यिकीय फरकांचे मूल्यांकन करण्यासाठी वापरल्या गेल्या आहेत.आजीवन (τ) च्या पिक्सेल-बाय-पिक्सेल विश्लेषणासाठी, प्रत्येक चॅनेलसाठी फील्डवरील एकूण क्षीणनची गणना केली गेली आणि 2/3-घटक घातांकीय क्षीणन मॉडेलचे अंदाजे मोजले गेले.प्रत्येक पिक्सेलसाठी लाइफटाईम अॅटेन्युएशन नंतर पूर्वी मोजलेल्या τ मूल्यांचा वापर करून फिट केले गेले, परिणामी स्यूडोकलर FLIM फिट प्रतिमा तयार झाली.एकाच चॅनेलच्या सर्व प्रतिमांमध्ये टेल-फिट आजीवन श्रेणी समान होती आणि प्रत्येक क्षयने विश्वासार्ह फिट प्रदान करण्यासाठी पुरेसे फोटॉन तयार केले.FRET विश्लेषणासाठी, 100 फोटॉनचा कमी तीव्रतेचा थ्रेशोल्ड लागू करून पिक्सेल निवडले गेले, जे 11 फोटॉनचे पार्श्वभूमी सिग्नल (FBG) सरासरी होते.प्रत्येक चॅनेलची फ्लूरोसेन्स तीव्रता प्रायोगिकरित्या निर्धारित सुधारणा घटकांद्वारे दुरुस्त केली गेली: 69 स्पेक्ट्रल क्रॉसस्टॉक α 0.004, थेट उत्तेजना β 0.0305, शोध कार्यक्षमता γ 0.517 होती.पिक्सेल स्तरावरील FRET कार्यक्षमता नंतर खालील समीकरण वापरून मोजली जाते:
जिथे FDD ही दाता (हिरव्या) वाहिनीमध्ये आढळलेली फ्लोरोसेन्स तीव्रता आहे, FDA ही अप्रत्यक्ष उत्तेजना अंतर्गत स्वीकारणार्‍या (लाल) चॅनेलमध्ये आढळलेली प्रतिदीप्ति तीव्रता आहे आणि FAA ही थेट उत्तेजना अंतर्गत स्वीकारणार्‍या (लाल) वाहिनीमध्ये आढळलेली प्रतिदीप्ति तीव्रता आहे. PIE).चॅनेलमध्ये फ्लोरोसेन्स तीव्रतेच्या डाळींचे निरीक्षण केले जाते).
LLPS बफरमध्ये 25 µM अनलेबल मोनोमेरिक Tau441 (25 µM αS सह किंवा शिवाय) असलेली 100 μl LLPS प्रतिक्रिया सोल्यूशन्स चिकट फॉइल कोटिंगसह नॉन-बाइंडिंग 96-वेल मायक्रोप्लेट्सवर ठेवा आणि डब्ल्यूएफ फॉर्मद्वारे मायक्रोप्लेट्सची तपासणी केली गेली. समतोल10 मिनिटांच्या आत.खोलीच्या तपमानावर उष्मायनाच्या 48 तासांनंतर, प्रोटीन राफ्ट्स आणि स्पॉट्सच्या उपस्थितीची पुष्टी झाली.नंतर विहिरीतील तराफ्यांवरचा द्रव काळजीपूर्वक काढून टाका, त्यानंतर 50 एल डिसोसिएशन बफर (10 मिमी HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) घाला आणि 10 मिनिटे उबवा.उच्च मीठ एकाग्रता हे सुनिश्चित करते की अवशिष्ट PEG मुळे LLPS ची पुनरावृत्ती होणार नाही आणि केवळ इलेक्ट्रोस्टॅटिक परस्परसंवादाने तयार होणारे संभाव्य प्रोटीन असेंब्ली वेगळे केले जातील.त्यानंतर विहिरीच्या तळाला मायक्रोपिपेट टीपने काळजीपूर्वक स्क्रॅप केले गेले आणि परिणामी द्रावण रिकाम्या निरीक्षण विहिरीमध्ये हस्तांतरित केले गेले.1 तासासाठी 50 μM ThT सह नमुने उष्मायनानंतर, वेगळ्या स्पॉट्सची उपस्थिती WF मायक्रोस्कोपीद्वारे तपासली गेली.PBS मध्ये 70-µM αS द्रावणाचे 300 μl pH 7.4 सह, सोडियम अझाइड 0.01% 37 °C वर आणि 200 rpm ऑर्बिटल शेकरवर 7 दिवस उष्मायन करून सोनिकेटेड αS फायब्रिल्स तयार करा.त्यानंतर हे द्रावण 9600×g वर 30 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज केले गेले, गोळ्याला PBS pH 7.4 मध्ये पुन्हा सस्पेंड केले गेले आणि sonicated (1 मिनिट, 50% सायकल, Vibra-cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, USA मध्ये 80% मोठेपणा) fibril सॅम्पल लहान फायब्रिल्सच्या तुलनेने समान आकाराच्या वितरणासह.
FCS/FCCS विश्लेषण आणि दोन-रंग योगायोग शोध (TCCD) PIE मोड वापरून FLIM-FRET मायक्रोस्कोपी प्रयोगांसाठी वापरल्या जाणार्‍या त्याच MT200 टाइम-रिझोल्व्ह फ्लोरोसेंट कॉन्फोकल मायक्रोस्कोप (पिको-क्वांट, बर्लिन, जर्मनी) वर केले गेले.या प्रयोगांसाठी लेसर पॉवर 6.0 µW (481 nm) आणि 6.2 µW (637 nm) मध्ये जोडली गेली.या लेसर शक्तींचे संयोजन इष्टतम गणना दर साध्य करताना आणि फोटोब्लीचिंग आणि संपृक्तता टाळताना वापरल्या जाणार्‍या फ्लोरोफोर्सच्या जोड्यांसाठी समान चमक निर्माण करण्यासाठी निवडले गेले.दोन्ही डेटा संकलन आणि विश्लेषण व्यावसायिकरित्या उपलब्ध SymphoTime64 आवृत्ती 2.3 सॉफ्टवेअर (PicoQuant, बर्लिन, जर्मनी) वापरून केले गेले.
LLPS वापरून मिळविलेले पृथक αS/Tau समुच्चयांचे नमुने पृथक्करण बफरमध्ये योग्य मोनोमोलेक्युलर एकाग्रतेसाठी पातळ केले जातात (सामान्यत: 1:500 डायल्युशन, कारण कोसर्व्हेट नमुन्यांपासून वेगळे केल्यावर एकत्रित कमी एकाग्रतेवर असतात).1 mg/mL च्या एकाग्रतेवर BSA सोल्यूशनसह प्रीकोट केलेल्या कव्हरस्लिप्स (कॉर्निंग, यूएसए) वर नमुने थेट लागू केले गेले.
हिरव्या आणि लाल चॅनेलमधील PIE-smFRET विश्लेषणासाठी, मोनोमेरिक इव्हेंट्समुळे कमी तीव्रतेचे सिग्नल फिल्टर करण्यासाठी 25 फोटॉनचा कमी तीव्रता थ्रेशोल्ड लागू करण्यात आला होता (लक्षात ठेवा की पृथक समुच्चयांच्या तुलनेत मोनोमर्स एकत्रित नमुन्यांपेक्षा जास्त आहेत).या थ्रेशोल्डची गणना शुद्ध मोनोमर नमुन्यांच्या विश्लेषणातून प्राप्त झालेल्या मोनोमेरिक αS च्या सरासरी तीव्रतेच्या पाच पट विश्लेषणासाठी एकत्रितपणे निवडण्यासाठी केली गेली.PIE ड्राइव्ह सर्किटने, TSCPC डेटा संपादनासह, लाइफटाईम वेटिंग फिल्टरचा अनुप्रयोग सक्षम केला आहे जो पार्श्वभूमी आणि स्पेक्ट्रल क्रॉसस्टॉक दूर करण्यात मदत करतो.वरील थ्रेशोल्ड वापरून निवडलेली फ्लेअर तीव्रता केवळ-बफर नमुन्यांची तीव्रता/बिन विरुद्ध घटनेच्या हिस्टोग्रामवरून निर्धारित सरासरी पार्श्वभूमी सिग्नल वापरून दुरुस्त केली गेली.मोठ्या समुच्चयांशी संबंधित बर्स्ट्स सामान्यत: टाइम ट्रेसमध्ये (1 ms वर सेट) सलग अनेक डब्बे व्यापतात.या प्रकरणांमध्ये, जास्तीत जास्त ताकदीचा एक बिन निवडला गेला.FRET आणि stoichiometric विश्लेषणासाठी, सैद्धांतिकदृष्ट्या निर्धारित गॅमा घटक γ (0.517) वापरला गेला.स्पेक्ट्रल क्रॉसस्टॉक आणि थेट उत्तेजित योगदान नगण्य (प्रायोगिकरित्या निर्धारित) वापरल्या जाणार्‍या उत्तेजना लेसर पॉवरमध्ये आहे.स्फोटातील FRET ची कार्यक्षमता आणि स्टोचिओमेट्री खालीलप्रमाणे मोजली जाते.