Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद.तुम्ही मर्यादित CSS समर्थनासह ब्राउझर आवृत्ती वापरत आहात.सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये सुसंगतता मोड अक्षम करा).याव्यतिरिक्त, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही शैली आणि JavaScript शिवाय साइट दर्शवतो.
प्रति स्लाइड तीन लेख दर्शवणारे स्लाइडर.स्लाइड्समधून जाण्यासाठी मागील आणि पुढील बटणे वापरा किंवा प्रत्येक स्लाइडमधून जाण्यासाठी शेवटी स्लाइड कंट्रोलर बटणे वापरा.

317 स्टेनलेस स्टील कॉइल टयूबिंग पुरवठादार

स्टेनलेस स्टील सामग्रीची रासायनिक रचना सारणी

SPACA6 हे शुक्राणूंनी व्यक्त केलेले पृष्ठभाग प्रथिने आहे जे सस्तन प्राण्यांच्या लैंगिक पुनरुत्पादनादरम्यान गेमेट संलयनासाठी महत्त्वपूर्ण आहे.ही मूलभूत भूमिका असूनही, SPACA6 चे विशिष्ट कार्य खराब समजले आहे.आम्ही 2.2 Å च्या रिझोल्यूशनवर SPACA6 च्या एक्स्ट्रासेल्युलर डोमेनची स्फटिक रचना स्पष्ट करतो, चार-अडकलेले बंडल आणि अर्ध-लवचिक लिंकर्सद्वारे जोडलेले Ig-सारखे β-सँडविच बनलेले दोन-डोमेन प्रोटीन प्रकट करते.ही रचना IZUMO1 सारखी आहे, आणखी एक गेमेट फ्यूजन-संबंधित प्रथिने, SPACA6 आणि IZUMO1 यांना IST सुपरफॅमिली म्हणून ओळखल्या जाणार्‍या गर्भाधान-संबंधित प्रथिनांच्या सुपरफॅमिलीचे संस्थापक सदस्य बनवते.IST सुपरफॅमिली त्याच्या वळण घेतलेल्या चार-हेलिक्स बंडल आणि डायसल्फाइड-लिंक्ड CXXC आकृतिबंधांच्या जोडीने संरचनात्मकपणे परिभाषित केले आहे.मानवी प्रोटीओमच्या रचना-आधारित अल्फाफोल्ड शोधाने या अतिपरिवारातील अतिरिक्त प्रथिने सदस्य ओळखले;विशेष म्हणजे, यातील अनेक प्रथिने गेमेट फ्यूजनमध्ये गुंतलेली असतात.SPACA6 ची रचना आणि IST च्या इतर सदस्यांशी असलेला त्याचा संबंध सस्तन प्राण्यांच्या गेमेट फ्यूजनच्या आमच्या ज्ञानातील गहाळ दुवा प्रदान करतो.
प्रत्येक मानवी जीवनाची सुरुवात दोन वेगळ्या हॅप्लॉइड गेमेट्सने होते: वडिलांचे शुक्राणू आणि आईची अंडी.हा शुक्राणू एक तीव्र निवड प्रक्रियेचा विजेता आहे ज्या दरम्यान लाखो शुक्राणू पेशी महिला जननेंद्रियाच्या मार्गातून जातात, विविध अडथळ्यांवर मात करतात1 आणि कॅपेसिटेशनमधून जातात, ज्यामुळे त्यांची गतिशीलता आणि पृष्ठभागाच्या घटकांची प्रक्रिया वाढते 2,3,4.जरी शुक्राणू आणि oocyte एकमेकांना शोधले तरीही प्रक्रिया अद्याप संपलेली नाही.oocyte भोवती क्यूम्युलस पेशींचा एक थर असतो आणि झोना पेलुसिडा नावाचा ग्लायकोप्रोटीन अडथळा असतो, ज्यातून शुक्राणूंना oocyte मध्ये प्रवेश करणे आवश्यक आहे.या अंतिम अडथळ्यांवर मात करण्यासाठी स्पर्मेटोझोआ पृष्ठभागावरील आसंजन रेणू आणि झिल्ली-संबंधित आणि स्रावित एन्झाईम्सच्या मिश्रणाचा वापर करतात.हे रेणू आणि एन्झाईम्स प्रामुख्याने आतील पडद्यामध्ये आणि अॅक्रोसोमल मॅट्रिक्समध्ये साठवले जातात आणि जेव्हा शुक्राणूंच्या बाह्य झिल्लीला अॅक्रोसोमल रिअॅक्शन दरम्यान लाइसेड केले जाते तेव्हा ते शोधले जातात.या तीव्र प्रवासातील अंतिम टप्पा म्हणजे शुक्राणू-अंडी संलयन घटना, ज्यामध्ये दोन पेशी त्यांच्या पडद्याला एकत्र करून एकच द्विगुणित जीव बनतात7.जरी ही प्रक्रिया मानवी पुनरुत्पादनात महत्त्वाची असली तरी, आवश्यक आण्विक परस्परसंवाद फारसे समजलेले नाहीत.
गेमेट्सच्या निषेचन व्यतिरिक्त, दोन लिपिड बायलेयर्सच्या फ्यूजनच्या रसायनशास्त्राचा विस्तृत अभ्यास केला गेला आहे.सर्वसाधारणपणे, मेम्ब्रेन फ्यूजन ही एक उत्साही प्रतिकूल प्रक्रिया आहे ज्यासाठी स्ट्रक्चरल कॉन्फॉर्मेशन बदल घडवून आणण्यासाठी प्रोटीन उत्प्रेरक आवश्यक आहे जे दोन झिल्ली एकमेकांच्या जवळ आणते, त्यांची सातत्य खंडित करते आणि फ्यूजन 8,9 निर्माण करते.हे प्रथिने उत्प्रेरक फ्युसोजेन्स म्हणून ओळखले जातात आणि असंख्य फ्यूजन प्रणालींमध्ये आढळले आहेत.ते यजमान पेशींमध्ये व्हायरल प्रवेशासाठी आवश्यक आहेत (उदा., HIV-1 मध्ये gp160, कोरोनाव्हायरसमध्ये स्पाइक, इन्फ्लूएंझा व्हायरसमध्ये हेमॅग्लुटिनिन) 10,11,12 प्लेसेंटल (सिंसिटिन) 13,14,15 आणि खालच्या युकेरियोट्समध्ये गेमेट-फॉर्मिंग फ्यूजन ( HAP2/GCS1 वनस्पती, प्रोटिस्ट आणि आर्थ्रोपॉड्स) 16,17,18,19.मानवी गेमेट्ससाठी फ्युसोजेन्स अद्याप शोधले गेले नाहीत, जरी अनेक प्रथिने गेमेट संलग्नक आणि संलयनासाठी महत्त्वपूर्ण असल्याचे दर्शविले गेले आहे.oocyte-expressed CD9, उंदीर आणि मानवी गेमेट्सच्या संलयनासाठी आवश्यक असलेले ट्रान्समेम्ब्रेन प्रोटीन, 21,22,23 शोधण्यात आलेले पहिले होते.त्याचे नेमके कार्य अस्पष्ट असले तरी, चिकटपणाची भूमिका, अंड्यातील मायक्रोव्हिलीवरील आसंजन केंद्राची रचना आणि/किंवा oocyte पृष्ठभागाच्या प्रथिनांचे योग्य स्थानिकीकरण 24,25,26 असे दिसते.गेमेट संलयनासाठी महत्त्वाची असणारी दोन सर्वात सामान्य प्रथिने म्हणजे शुक्राणू प्रथिने IZUMO127 आणि oocyte प्रोटीन JUNO28 आणि त्यांचे परस्पर संबंध हे संलयनाच्या अगोदर गेमेट ओळखणे आणि चिकटणे यातील एक महत्त्वाचा टप्पा आहे.नर इझुमो1 नॉकआउट उंदीर आणि मादी जुनो नॉकआउट उंदीर पूर्णपणे निर्जंतुक आहेत, या मॉडेल्समध्ये शुक्राणू पेरिव्हिटेललाइन जागेत प्रवेश करतात परंतु गेमेट्स फ्यूज होत नाहीत.त्याचप्रमाणे, मानवी इन विट्रो फर्टिलायझेशन प्रयोगांमध्ये जेव्हा गेमेट्सवर अँटी-IZUMO1 किंवा JUNO27,29 अँटीबॉडीजसह उपचार केले गेले तेव्हा संगम कमी झाला.
अलीकडेच, IZUMO1 आणि JUNO20,30,31,32,33,34,35 प्रमाणेच शुक्राणू-व्यक्त प्रथिनांचा एक नवीन शोध लावला गेला आहे.स्पर्म अॅक्रोसोमल मेम्ब्रेन-संबंधित प्रथिने 6 (SPACA6) मोठ्या प्रमाणात म्युरिन म्युटाजेनेसिस अभ्यासामध्ये गर्भाधानासाठी आवश्यक म्हणून ओळखले गेले आहे.Spaca6 जनुकामध्ये ट्रान्सजीन टाकल्याने नॉनफ्यूसिबल स्पर्मेटोझोआ तयार होतो, जरी हे शुक्राणु पेरिव्हिटेललाइन स्पेसमध्ये घुसतात 36.उंदरांवरील नंतरच्या नॉकआउट अभ्यासांनी पुष्टी केली की गेमेट फ्यूजन 30,32 साठी Spaca6 आवश्यक आहे.SPACA6 जवळजवळ केवळ अंडकोषांमध्ये व्यक्त केले जाते आणि IZUMO1 प्रमाणे स्थानिकीकरण पॅटर्न आहे, म्हणजे अॅक्रोसोमल प्रतिक्रियापूर्वी शुक्राणूंच्या अंतर्भागात, आणि नंतर अॅक्रोसोमल प्रतिक्रिया 30,32 नंतर विषुववृत्तीय प्रदेशात स्थलांतरित होते.Spaca6 homologues विविध सस्तन प्राण्यांमध्ये आणि इतर युकेरियोट्स 30 मध्ये अस्तित्त्वात आहेत आणि मानवी गेमेट फ्यूजनसाठी त्याचे महत्त्व SPACA6 30 ला प्रतिकार करून विट्रोमध्ये मानवी गर्भाधान रोखून दाखवले गेले आहे.IZUMO1 आणि JUNO च्या विपरीत, SPACA6 ची रचना, परस्परसंवाद आणि कार्याचे तपशील अस्पष्ट आहेत.
मानवी शुक्राणू आणि अंडी यांच्या संमिश्रणातील मूलभूत प्रक्रिया अधिक चांगल्या प्रकारे समजून घेण्यासाठी, ज्यामुळे आम्हाला कुटुंब नियोजन आणि प्रजनन उपचारांमधील भविष्यातील घडामोडींची माहिती देता येईल, आम्ही SPACA6 संरचनात्मक आणि जैवरासायनिक अभ्यास केला.SPACA6 च्या एक्स्ट्रासेल्युलर डोमेनची क्रिस्टल रचना चार-हेलिकल बंडल (4HB) आणि अर्ध-लवचिक प्रदेशांद्वारे जोडलेले इम्युनोग्लोबुलिन-सारखे (Ig-सारखे) डोमेन दर्शवते.मागील अभ्यासात भाकीत केल्याप्रमाणे, 7,32,37 SPACA6 ची डोमेन रचना मानवी IZUMO1 सारखी आहे, आणि दोन प्रथिने एक असामान्य स्वरूप सामायिक करतात: 4HB त्रिकोणी हेलिकल पृष्ठभाग आणि डायसल्फाइड-लिंक्ड CXXC आकृतिबंधांची जोडी.आम्ही प्रस्तावित करतो की IZUMO1 आणि SPACA6 आता गेमेट फ्यूजनशी संबंधित प्रथिनांचे एक मोठे, संरचनात्मकदृष्ट्या संबंधित सुपरफॅमिली परिभाषित करतात.सुपरफॅमिलीसाठी अद्वितीय वैशिष्ट्यांचा वापर करून, आम्ही अल्फाफोल्ड स्ट्रक्चरल मानवी प्रोटीओमसाठी संपूर्ण शोध घेतला, ज्यामध्ये गेमेट फ्यूजन आणि/किंवा फर्टिलायझेशनमध्ये सहभागी असलेल्या अनेक सदस्यांसह या सुपरफॅमिलीच्या अतिरिक्त सदस्यांची ओळख पटवली.आता असे दिसते की गेमेट फ्यूजनशी संबंधित प्रथिनेंचा एक सामान्य संरचनात्मक पट आणि सुपरफॅमिली आहे आणि आमची रचना मानवी गेमेट फ्यूजन यंत्रणेच्या या महत्त्वाच्या पैलूचा आण्विक नकाशा प्रदान करते.
SPACA6 हे एकल-पास ट्रान्समेम्ब्रेन प्रोटीन आहे ज्यामध्ये एक एन-लिंक केलेले ग्लाइकन आणि सहा पुटेटिव्ह डायसल्फाइड बॉण्ड्स (आकडे S1a आणि S2) आहेत.आम्ही ड्रोसोफिला S2 पेशींमध्ये मानवी SPACA6 (अवशेष 27–246) चे बाह्य कोशिकीय डोमेन व्यक्त केले आणि निकेल ऍफिनिटी, कॅशन एक्सचेंज आणि आकार बहिष्कार क्रोमॅटोग्राफी (Fig. S1b) वापरून प्रथिने शुद्ध केली.शुद्ध केलेले SPACA6 एक्टोडोमेन अतिशय स्थिर आणि एकसंध आहे.पॉलीगोनल लाइट स्कॅटरिंग (SEC-MALS) सह एकत्रित आकार अपवर्जन क्रोमॅटोग्राफी वापरून विश्लेषणाने 26.2 ± 0.5 kDa (Fig. S1c) च्या गणना केलेल्या आण्विक वजनासह एक शिखर उघड केले.हे SPACA6 मोनोमेरिक एक्टोडोमेनच्या आकाराशी सुसंगत आहे, हे दर्शविते की शुद्धीकरणादरम्यान ऑलिगोमेरायझेशन झाले नाही.याव्यतिरिक्त, वर्तुळाकार डायक्रोइझम (CD) स्पेक्ट्रोस्कोपीने 51.3 °C (Fig. S1d,e) च्या वितळण्याच्या बिंदूसह मिश्रित α/β रचना प्रकट केली.सीडी स्पेक्ट्राच्या डीकॉनव्होल्यूशनने 38.6% α-हेलिकल आणि 15.8% β-स्ट्रँडेड घटक (आकृती S1d) प्रकट केले.
SPACA6 एक्टोडोमेन यादृच्छिक मॅट्रिक्स सीडिंग 38 वापरून क्रिस्टलाइज केले गेले होते परिणामी 2.2 Å (टेबल 1 आणि आकृती S3) च्या रिझोल्यूशनसह डेटा सेट झाला.रचना निश्चितीसाठी (टेबल 1 आणि आकृती S4) ब्रोमाइड एक्सपोजरसह फ्रॅगमेंट-आधारित आण्विक प्रतिस्थापन आणि SAD फेजिंग डेटाचे संयोजन वापरून, अंतिम परिष्कृत मॉडेलमध्ये 27-246 अवशेष असतात.ज्या वेळी रचना निश्चित केली गेली, तेथे प्रायोगिक किंवा अल्फाफोल्ड संरचना उपलब्ध नव्हत्या.SPACA6 एक्टोडोमेन 20 Å × 20 Å × 85 Å मोजते, त्यात सात हेलिकेस आणि नऊ β-स्ट्रॅंड असतात आणि सहा डायसल्फाइड बॉन्ड्स (चित्र 1a, b) द्वारे स्थिर केलेला एक वाढवलेला तृतीयक पट असतो.Asn243 बाजूच्या साखळीच्या शेवटी कमकुवत इलेक्ट्रॉन घनता दर्शवते की हे अवशेष एन-लिंक केलेले ग्लायकोसिलेशन आहे.संरचनेत दोन डोमेन असतात: एक N-टर्मिनल चार-हेलिक्स बंडल (4HB) आणि एक C-टर्मिनल Ig-सारखे डोमेन ज्यामध्ये मध्यवर्ती बिजागर प्रदेश असतो (चित्र 1c).
SPACA6 च्या एक्स्ट्रासेल्युलर डोमेनची रचना.SPACA6 च्या एक्स्ट्रासेल्युलर डोमेनचा स्ट्रिप डायग्राम, N पासून C-टर्मिनस पर्यंतच्या साखळीचा रंग गडद निळा ते गडद लाल.डायसल्फाइड बॉण्ड्समध्ये गुंतलेले सिस्टीन किरमिजी रंगात हायलाइट केले जातात.b SPACA6 च्या बाह्य सेल्युलर डोमेनचे टोपोलॉजी.आकृती 1a प्रमाणेच रंगसंगती वापरा.c SPACA6 एक्स्ट्रासेल्युलर डोमेन.4HB, बिजागर, आणि Ig-सारखे डोमेन स्ट्रिप चार्ट अनुक्रमे केशरी, हिरवे आणि निळे रंगीत आहेत.स्तर मोजण्यासाठी काढलेले नाहीत.
SPACA6 च्या 4HB डोमेनमध्ये चार मुख्य हेलिकेस (हेलिसेस 1-4) समाविष्ट आहेत, जे हेलिकल हेलिक्स (Fig. 2a) च्या रूपात मांडलेले आहेत, समांतर आणि समांतर परस्परसंवाद (Fig. 2b) दरम्यान बदलतात.एक लहान अतिरिक्त सिंगल-टर्न हेलिक्स (हेलिक्स 1′) बंडलला लंबवत ठेवलेले आहे, हेलिकेस 1 आणि 2 सह त्रिकोण बनवते. हा त्रिकोण हेलिकेस 3 आणि 4 च्या तुलनेने दाट पॅकिंगच्या हेलिकल-ट्विस्टेड पॅकिंगमध्ये किंचित विकृत आहे ( अंजीर 2a).
4HB N-टर्मिनल पट्टी चार्ट.b चार हेलिक्सच्या बंडलचे शीर्ष दृश्य, प्रत्येक हेलिक्स N-टर्मिनसवर गडद निळ्या आणि C-टर्मिनसवर गडद लाल रंगात हायलाइट केलेले आहे.c 4HB साठी टॉप-डाउन सर्पिल व्हील आकृती, प्रत्येक अवशेष एका वर्तुळात एकल-अक्षर अमीनो ऍसिड कोडसह लेबल केले आहे;चाकाच्या शीर्षस्थानी फक्त चार अमीनो ऍसिड्स क्रमांकित आहेत.नॉन-ध्रुवीय अवशेष रंगीत पिवळे असतात, ध्रुवीय चार्ज न केलेले अवशेष रंगीत हिरव्या असतात, सकारात्मक चार्ज केलेले अवशेष रंगीत निळे असतात आणि नकारात्मक चार्ज केलेले अवशेष लाल रंगाचे असतात.d 4HB डोमेनचे त्रिकोणी चेहरे, 4HB नारिंगी आणि बिजागर हिरव्या रंगात.दोन्ही इनसेट रॉड-आकाराचे डायसल्फाइड बंध दर्शवतात.
4HB आतील हायड्रोफोबिक कोरवर केंद्रित आहे जो मुख्यतः अ‍ॅलिफॅटिक आणि सुगंधी अवशेषांनी बनलेला आहे (चित्र 2c).कोरमध्ये Cys41 आणि Cys55 मधील एक डायसल्फाइड बॉण्ड आहे जो हेलिकेस 1 आणि 2 ला वरच्या उंच त्रिकोणामध्ये जोडतो (चित्र 2d).हेलिक्स 1′ मधील CXXC मोटिफ आणि बिजागर प्रदेशात β-हेअरपिनच्या टोकावर आढळलेले दुसरे CXXC मोटिफ यांच्यामध्ये दोन अतिरिक्त डायसल्फाइड बंध तयार झाले (चित्र 2d).अज्ञात फंक्शन (Arg37) असलेले पुराणमतवादी आर्जिनिन अवशेष हेलिकेस 1′, 1 आणि 2 द्वारे तयार केलेल्या पोकळ त्रिकोणाच्या आत स्थित आहे. अ‍ॅलिफॅटिक कार्बन अणू Cβ, Cγ आणि Cδ Arg37 हायड्रोफोबिक कोरशी संवाद साधतात आणि त्याचे ग्वानिडाइन गट चक्रीयपणे हलतात. हेलिसेस 1′ आणि 1 दरम्यान Thr32 पाठीचा कणा आणि बाजूची साखळी (Fig. S5a,b) यांच्यातील परस्परसंवादाद्वारे.Tyr34 पोकळीमध्ये दोन लहान पोकळी सोडून विस्तारते ज्याद्वारे Arg37 विद्राव्यांशी संवाद साधू शकतो.
Ig-समान β-सँडविच डोमेन हे प्रथिनांचे एक मोठे सुपरफॅमिली आहेत जे हायड्रोफोबिक कोर 39 द्वारे परस्पर संवाद साधणाऱ्या दोन किंवा अधिक मल्टी-स्ट्रॅंडेड अॅम्फिपॅथिक β-शीट्सचे सामायिक वैशिष्ट्य सामायिक करतात. SPACA6 च्या C-टर्मिनल Ig-सदृश डोमेनमध्ये समान नमुना आहे आणि दोन स्तरांचा समावेश आहे (Fig. S6a).शीट 1 ही चार स्ट्रँड्सची β-शीट आहे (स्ट्रँड्स D, F, H, आणि I) जिथे स्ट्रँड्स F, H, आणि I एक अँटी-पॅरलल व्यवस्था तयार करतात आणि I आणि D स्ट्रँड्स समांतर परस्पर क्रिया करतात.तक्ता 2 एक लहान अँटी-पॅरलल डबल-स्ट्रँडेड बीटा शीट आहे (स्ट्रँड्स ई आणि जी).ई साखळीचे सी-टर्मिनस आणि एच चेन (Cys170-Cys226) (Fig. S6b) च्या मध्यभागी अंतर्गत डायसल्फाइड बंध दिसून आला.हा डायसल्फाइड बाँड इम्युनोग्लोब्युलिन 40,41 च्या β-सँडविच डोमेनमधील डायसल्फाइड बाँडशी समान आहे.
चार-स्ट्रँड β-शीट त्याच्या संपूर्ण लांबीवर फिरते, आकार आणि इलेक्ट्रोस्टॅटिक्समध्ये भिन्न असममित कडा तयार करतात.पातळ किनार हा एक सपाट हायड्रोफोबिक पर्यावरणीय पृष्ठभाग आहे जो SPACA6 (Fig. S6b,c) मधील उर्वरित असमान आणि इलेक्ट्रोस्टॅटिकली वैविध्यपूर्ण पृष्ठभागांच्या तुलनेत वेगळा आहे.हायड्रोफोबिक पृष्ठभागाच्या भोवती उघडलेल्या पाठीचा कणा कार्बोनिल/अमीनो गट आणि ध्रुवीय बाजूच्या साखळ्यांचा प्रभामंडल (Fig. S6c).विस्तीर्ण मार्जिन एका आच्छादित हेलिकल सेगमेंटने झाकलेले आहे जे हायड्रोफोबिक कोरच्या N-टर्मिनल भागाला अवरोधित करते आणि F चेन बॅकबोन (Fig. S6d) च्या खुल्या ध्रुवीय गटासह तीन हायड्रोजन बंध तयार करतात.या काठाचा सी-टर्मिनल भाग अंशतः उघड झालेल्या हायड्रोफोबिक कोरसह एक मोठा खिसा बनवतो.दुहेरी आर्जिनिन अवशेष (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 आणि Arg212-Arg214) आणि मध्यवर्ती हिस्टिडाइन (His220) (आकृती S6e) च्या तीन संचांमुळे खिसा सकारात्मक शुल्कांनी वेढलेला असतो.
बिजागर क्षेत्र हे हेलिकल डोमेन आणि Ig-सारख्या डोमेनमधील एक लहान विभाग आहे, ज्यामध्ये एक अँटी-पॅरलल थ्री-स्ट्रँडेड β-लेयर (स्ट्रँड्स A, B आणि C), एक लहान 310 हेलिक्स आणि अनेक लांब यादृच्छिक हेलिकल सेगमेंट असतात.(Fig. S7).बिजागर प्रदेशातील सहसंयोजक आणि इलेक्ट्रोस्टॅटिक संपर्कांचे नेटवर्क 4HB आणि Ig-सारख्या डोमेनमधील अभिमुखता स्थिर करते असे दिसते.नेटवर्क तीन भागांमध्ये विभागले जाऊ शकते.पहिल्या भागामध्ये दोन CXXC आकृतिबंध (27CXXC30 आणि 139CXXC142) समाविष्ट आहेत जे बिजागरातील β-हेअरपिन आणि 4HB मधील 1′ हेलिक्स दरम्यान डायसल्फाइड बंधांची जोडी तयार करतात.दुसऱ्या भागात Ig-सारखे डोमेन आणि बिजागर यांच्यातील इलेक्ट्रोस्टॅटिक परस्परसंवाद समाविष्ट आहेत.बिजागरातील Glu132 Ig-सारख्या डोमेनमध्ये Arg233 आणि बिजागरात Arg135 सह मीठ पूल बनवते.तिसर्‍या भागात Ig-सारखे डोमेन आणि बिजागर क्षेत्र यांच्यातील सहसंयोजक बंध समाविष्ट आहेत.दोन डायसल्फाइड बॉण्ड्स (Cys124-Cys147 आणि Cys128-Cys153) बिजागर लूपला लिंकरशी जोडतात जे Gln131 आणि बॅकबोन फंक्शनल ग्रुपमधील इलेक्ट्रोस्टॅटिक परस्परसंवादाद्वारे स्थिर होते, ज्यामुळे पहिल्या Ig-सारख्या डोमेनमध्ये प्रवेश मिळतो.साखळी
SPACA6 ectodomain ची रचना आणि 4HB आणि Ig-सारखी डोमेनची वैयक्तिक संरचना प्रथिने डेटाबेस 42 मध्ये संरचनात्मकदृष्ट्या समान रेकॉर्ड शोधण्यासाठी वापरली गेली.आम्ही उच्च Dali Z स्कोअर, लहान मानक विचलन आणि मोठ्या LALI स्कोअरसह सामने ओळखले (नंतरचे म्हणजे संरचनात्मकदृष्ट्या समतुल्य अवशेषांची संख्या).पूर्ण एक्टोडोमेन शोध (टेबल S1) मधील पहिल्या 10 हिट्सचा स्वीकार्य Z-स्कोअर >842 होता, तर केवळ 4HB किंवा Ig-सारख्या डोमेनसाठी केलेल्या शोधात असे दिसून आले की यापैकी बहुतेक हिट केवळ β-सँडविचशी संबंधित आहेत.अनेक प्रथिनांमध्ये आढळणारा सर्वव्यापी पट.Dali मधील तीनही शोधांनी फक्त एकच परिणाम दिला: IZUMO1.
SPACA6 आणि IZUMO1 7,32,37 संरचनात्मक समानता सामायिक करतात असे फार पूर्वीपासून सुचवले गेले आहे.जरी या दोन गेमेट फ्यूजन-संबंधित प्रथिनांचे एक्टोडोमेन केवळ 21% अनुक्रम ओळख (आकृती S8a) सामायिक करत असले तरी, संरक्षित डायसल्फाइड बाँड पॅटर्न आणि SPACA6 मधील अंदाजित C-टर्मिनल Ig-सारख्या डोमेनसह जटिल पुरावे, लवकर तयार करण्याच्या प्रयत्नांना परवानगी देतात. IZUMO1 चा टेम्प्लेट म्हणून वापर करून A a SPACA6 माऊसचे homology मॉडेल37.आमची रचना या अंदाजांची पुष्टी करते आणि समानतेची खरी डिग्री दर्शवते.खरं तर, SPACA6 आणि IZUMO137,43,44 संरचना समान द्वि-डोमेन आर्किटेक्चर (Fig. S8b) सामायिक करतात तत्सम 4HB आणि Ig-सारखे β-सँडविच डोमेन एका बिजागर प्रदेशाने (Fig. S8c) जोडलेले आहेत.
IZUMO1 आणि SPACA6 4HB मध्ये पारंपारिक सर्पिल बंडलपेक्षा सामान्य फरक आहेत.सामान्य 4HBs, जसे की एंडोसोमल फ्यूजन 45,46 मध्ये समाविष्ट असलेल्या SNARE प्रोटीन कॉम्प्लेक्समध्ये आढळतात, मध्य अक्ष 47 भोवती स्थिर वक्रता राखून समान अंतरावर असलेल्या हेलिकेस असतात. याउलट, IZUMO1 आणि SPACA6 या दोन्ही मधील हेलिकल डोमेन विकृत होते, व्हेरिएबल वक्रता सह. असमान पॅकिंग (आकृती S8d).हेलिक्स 1′, 1 आणि 2 द्वारे तयार झालेल्या त्रिकोणामुळे होणारे वळण, IZUMO1 आणि SPACA6 मध्ये कायम ठेवले जाते आणि हेलिक्स 1′ वर त्याच CXXC आकृतिबंधाने स्थिर केले जाते.तथापि, SPACA6 (Cys41 आणि Cys55 covalently helices 1 आणि 2 वर जोडणारे) मध्ये आढळलेले अतिरिक्त डायसल्फाइड बंध त्रिकोणाच्या शिखरावर एक तीक्ष्ण शिखर तयार करतात, SPACA6 अधिक स्पष्ट पोकळी त्रिकोणांसह, IZUMO1 पेक्षा अधिक वळणदार बनवतात.याव्यतिरिक्त, IZUMO1 मध्ये SPACA6 मध्ये या पोकळीच्या मध्यभागी आढळलेल्या Arg37 चा अभाव आहे.याउलट, IZUMO1 मध्ये अॅलिफॅटिक आणि सुगंधी अवशेषांचा अधिक वैशिष्ट्यपूर्ण हायड्रोफोबिक कोर आहे.
IZUMO1 मध्ये Ig-सारखे डोमेन आहे ज्यामध्ये डबल-स्ट्रँडेड आणि फाइव्ह-स्ट्रँडेड β-पत्रक43 आहे.IZUMO1 मधील अतिरिक्त स्ट्रँड SPACA6 मधील कॉइलची जागा घेते, जे स्ट्रँडमधील बॅकबोन हायड्रोजन बंध मर्यादित करण्यासाठी F स्ट्रँडशी संवाद साधते.तुलना करण्याचा एक मनोरंजक मुद्दा म्हणजे दोन प्रथिनांच्या Ig-सारख्या डोमेनचा अंदाजित पृष्ठभाग चार्ज.IZUMO1 पृष्ठभाग SPACA6 पृष्ठभागापेक्षा अधिक नकारात्मक चार्ज आहे.शुक्राणूंच्या पडद्याला तोंड देत सी-टर्मिनस जवळ अतिरिक्त शुल्क स्थित आहे.SPACA6 मध्ये, समान क्षेत्रे अधिक तटस्थ किंवा सकारात्मक चार्ज होते (Fig. S8e).उदाहरणार्थ, SPACA6 मधील हायड्रोफोबिक पृष्ठभाग (पातळ कडा) आणि सकारात्मक चार्ज केलेले खड्डे (विस्तृत कडा) IZUMO1 मध्ये नकारात्मक चार्ज केले जातात.
जरी IZUMO1 आणि SPACA6 मधील संबंध आणि दुय्यम संरचना घटक चांगले जतन केले गेले असले तरी, Ig-सारख्या डोमेनच्या संरचनात्मक संरेखनाने हे दाखवले की दोन डोमेन एकमेकांच्या सापेक्ष त्यांच्या सामान्य अभिमुखतेमध्ये भिन्न आहेत (Fig. S9).IZUMO1 चा सर्पिल बंडल β-सँडविच भोवती वक्र आहे, मध्य अक्षापासून सुमारे 50° वर पूर्वी वर्णन केलेला "बूमरँग" आकार तयार करतो.याउलट, SPACA6 मधील हेलिकल बीम विरुद्ध दिशेने सुमारे 10° झुकलेला होता.बिजागर प्रदेशातील फरकांमुळे या अभिमुखतेतील फरक संभवतो.प्राथमिक क्रम स्तरावर, IZUMO1 आणि SPACA6 मध्ये सिस्टीन, ग्लाइसिन आणि एस्पार्टिक ऍसिड अवशेषांचा अपवाद वगळता बिजागरावर थोडेसे समानता आहे.परिणामी, हायड्रोजन बंध आणि इलेक्ट्रोस्टॅटिक नेटवर्क पूर्णपणे भिन्न आहेत.β-शीट दुय्यम संरचना घटक IZUMO1 आणि SPACA6 द्वारे सामायिक केले जातात, जरी IZUMO1 मधील साखळी जास्त लांब आहेत आणि 310 हेलिक्स (हेलिक्स 5) SPACA6 साठी अद्वितीय आहे.या फरकांचा परिणाम दोन अन्यथा समान प्रथिनांसाठी भिन्न डोमेन अभिमुखतेमध्ये होतो.
आमच्या Dali सर्व्हर शोधातून असे दिसून आले आहे की SPACA6 आणि IZUMO1 या प्रथिन डेटाबेसमध्ये संग्रहित केलेल्या केवळ दोन प्रायोगिकरित्या निर्धारित संरचना आहेत ज्यात हा विशिष्ट 4HB फोल्ड (टेबल S1) आहे.अगदी अलीकडे, डीपमाइंड (अल्फाबेट/गुगल) ने अल्फाफोल्ड, एक न्यूरल नेटवर्क आधारित प्रणाली विकसित केली आहे जी प्राथमिक अनुक्रम ४८ पासून प्रथिनांच्या 3D संरचनांचा अचूक अंदाज लावू शकते.आम्ही SPACA6 रचना सोडवल्यानंतर थोड्याच वेळात, AlphaFold डेटाबेस जारी करण्यात आला, जो मानवी प्रोटीओम 48,49 मधील सर्व प्रथिनांपैकी 98.5% कव्हर करणारे भविष्यसूचक संरचना मॉडेल प्रदान करते.शोध मॉडेल म्हणून आमच्या निराकरण केलेल्या SPACA6 संरचनेचा वापर करून, अल्फाफोल्ड मानवी प्रोटीओममधील मॉडेलसाठी स्ट्रक्चरल होमोलॉजी शोधने SPACA6 आणि IZUMO1 मधील संभाव्य संरचनात्मक समानता असलेले उमेदवार ओळखले.SPACA6 (Fig. S10a)—विशेषत: 1.1 Å rms ectodomain ची भविष्यवाणी करताना आमच्या निराकरण केलेल्या संरचनेच्या (Fig. S10b) तुलनेत अल्फाफोल्डची अविश्वसनीय अचूकता दिल्यास—आम्ही खात्री बाळगू शकतो की ओळखलेल्या SPACA6 जुळण्या अचूक असण्याची शक्यता आहे.
पूर्वी, PSI-BLAST ने IZUMO1 क्लस्टरचा शोध तीन इतर शुक्राणू-संबंधित प्रथिनांसह केला: IZUMO2, IZUMO3 आणि IZUMO450.अल्फाफोल्डने भाकीत केले आहे की हे IZUMO फॅमिली प्रथिने 4HB डोमेनमध्ये IZUMO1 (आकृती 3a आणि S11) सारख्याच डायसल्फाइड बाँड पॅटर्नसह फोल्ड करतात, जरी त्यांच्याकडे Ig-सारखे डोमेन नसले तरी.असे गृहीत धरले जाते की IZUMO2 आणि IZUMO3 हे IZUMO1 सारखेच एकतर्फी पडदा प्रथिने आहेत, तर IZUMO4 स्त्रावलेले दिसते.गेमेट फ्यूजनमधील IZUMO 2, 3, आणि 4 प्रथिनेची कार्ये निर्धारित केलेली नाहीत.IZUMO3 शुक्राणूजन्य विकासादरम्यान ऍक्रोसोम बायोजेनेसिसमध्ये भूमिका बजावण्यासाठी ओळखले जाते51, आणि IZUMO प्रोटीन एक कॉम्प्लेक्स 50 बनवते.सस्तन प्राणी, सरपटणारे प्राणी आणि उभयचरांमध्ये IZUMO प्रथिनांचे संवर्धन सूचित करते की त्यांचे संभाव्य कार्य DCST1/2, SOF1 आणि FIMP सारख्या इतर ज्ञात गेमेट-फ्यूजन-संबंधित प्रथिनांशी सुसंगत आहे.
IST च्या सुपरफॅमिलीच्या डोमेन आर्किटेक्चरचा आकृती, 4HB, बिजागर, आणि Ig-सारखी डोमेन अनुक्रमे नारिंगी, हिरवी आणि निळ्या रंगात हायलाइट केली आहेत.IZUMO4 मध्ये एक अद्वितीय C-टर्मिनल प्रदेश आहे जो काळा दिसतो.पुष्टी केलेले आणि पुटेटिव्ह डायसल्फाइड बंध अनुक्रमे घन आणि ठिपके असलेल्या रेषांनी दर्शविले जातात.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (अल्फाफोल्ड DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (अल्फाफोल्ड DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (अल्फाफोल्ड DB: AF-Q1ZYLF1-F1), आणि AlphaFold-5 DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) पॅनेल A प्रमाणेच रंग श्रेणीमध्ये प्रदर्शित केले जातात. डायसल्फाइड बाँड किरमिजी रंगात दाखवले जातात.TMEM95, IZUMO2 आणि IZUMO3 ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिकेस दर्शविले नाहीत.
IZUMO प्रोटीनच्या विपरीत, इतर SPACA प्रथिने (म्हणजे, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, आणि SPACA9) SPACA6 (Fig. S12) पेक्षा संरचनात्मकदृष्ट्या भिन्न असल्याचे मानले जाते.फक्त SPACA9 मध्ये 4HB आहे, परंतु त्यात समान समांतर-अँटी-समांतर अभिमुखता किंवा SPACA6 प्रमाणे समान डायसल्फाइड बॉण्ड असणे अपेक्षित नाही.फक्त SPACA1 मध्ये समान Ig-सारखे डोमेन आहे.अल्फाफोल्डचा अंदाज आहे की SPACA3, SPACA4 आणि SPACA5 ची रचना SPACA6 पेक्षा पूर्णपणे वेगळी आहे.विशेष म्हणजे, SPACA4 देखील गर्भाधानात भूमिका बजावण्यासाठी ओळखले जाते, परंतु SPACA6 पेक्षा जास्त प्रमाणात, शुक्राणू आणि oocyte zona pellucida52 मधील परस्परसंवाद सुलभ करते.
आमच्या AlphaFold शोधात IZUMO1 आणि SPACA6 4HB, TMEM95 साठी दुसरी जुळणी आढळली.TMEM95, एकच शुक्राणू-विशिष्ट ट्रान्समेम्ब्रेन प्रोटीन, 32,33 कमी केल्यावर नर उंदरांना नापीक बनवते.TMEM95 नसलेल्या स्पर्मेटोझोआमध्ये सामान्य आकारविज्ञान, हालचाल आणि झोना पेलुसिडामध्ये प्रवेश करण्याची आणि अंड्याच्या पडद्याला जोडण्याची क्षमता होती, परंतु ते oocyte झिल्लीशी जोडू शकले नाहीत.मागील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की TMEM95 IZUMO133 सह संरचनात्मक समानता सामायिक करते.खरंच, अल्फाफोल्ड मॉडेलने पुष्टी केली की TMEM95 हे 4HB आहे ज्यात IZUMO1 आणि SPACA6 सारख्या CXXC आकृतिबंधांची जोडी आहे आणि SPACA6 (Fig. 3a आणि S11) मध्ये आढळलेल्या हेलिकेस 1 आणि 2 मधील समान अतिरिक्त डायसल्फाइड बॉण्ड आहे.जरी TMEM95 मध्ये Ig-सारखे डोमेन नसले तरी, त्यात SPACA6 आणि IZUMO1 बिजागर प्रदेशांप्रमाणेच डायसल्फाइड बाँड पॅटर्न असलेला प्रदेश आहे (चित्र 3b).या हस्तलिखिताच्या प्रकाशनाच्या वेळी, प्रीप्रिंट सर्व्हरने TMEM95 ची रचना नोंदवली, ज्याने AlphaFold53 निकालाची पुष्टी केली.TMEM95 हे SPACA6 आणि IZUMO1 सारखेच आहे आणि उत्क्रांतीनुसार आधीच उभयचरांमध्ये संरक्षित आहे (चित्र 4 आणि S13).
PSI-BLAST शोधाने जीवनवृक्षातील या अनुक्रमांची स्थिती निश्चित करण्यासाठी NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP आणि SOF1 डेटाबेस वापरले.शाखा बिंदूंमधील अंतर मोजण्यासाठी दर्शविले जात नाही.
SPACA6 आणि IZUMO1 मधील उल्लेखनीय एकंदर संरचनात्मक समानता सूचित करते की ते TMEM95 आणि IZUMO 2, 3, आणि 4 प्रथिने समाविष्ट असलेल्या संरक्षित संरचनात्मक सुपरफॅमिलीचे संस्थापक सदस्य आहेत.ज्ञात सदस्य: IZUMO1, SPACA6 आणि TMEM95.केवळ काही सदस्यांकडे Ig सारखी डोमेन असल्यामुळे, IST सुपरफॅमिलीचे वैशिष्ट्य म्हणजे 4HB डोमेन, ज्यात या सर्व प्रथिनांमध्ये सामान्य वैशिष्ट्यपूर्ण वैशिष्ट्ये आहेत: 1) समांतर/समांतर आवर्तने (चित्र 1) मध्ये हेलिकेससह गुंडाळलेले 4HB . 5a), 2) बंडलमध्ये त्रिकोणी चेहरा असतो ज्यामध्ये बंडलमध्ये दोन हेलिक्स असतात आणि तिसरे उभ्या हेलिक्स असतात (Fig. मुख्य क्षेत्र (Fig. 5c). थायोरेडॉक्सिन सारख्या प्रथिनांमध्ये आढळणारा CXXC आकृतिबंध कार्य करण्यासाठी ओळखला जातो. रेडॉक्स सेन्सर 54,55,56 म्हणून, तर IST कुटुंबातील सदस्यांमधील आकृतिबंध हे गॅमेट फ्यूजनमधील ERp57 सारख्या प्रोटीन डायसल्फाइड आयसोमेरेसेसशी संबंधित असू शकतात. भूमिका 57,58 संबंधित आहेत.
IST सुपरफॅमिलीचे सदस्य 4HB डोमेनच्या तीन वैशिष्ट्यपूर्ण वैशिष्ट्यांद्वारे परिभाषित केले जातात: समांतर आणि अँटी-पॅरलल ओरिएंटेशन दरम्यान चार हेलिकेस, बा-त्रिकोणीय हेलिकल बंडल चेहरे आणि लहान रेणूंमध्ये तयार केलेले ca CXXC दुहेरी स्वरूप.) एन-टर्मिनल हेलिक्स (नारिंगी) आणि बिजागर प्रदेश β-हेअरपिन (हिरवा).
SPACA6 आणि IZUMO1 मधील समानता लक्षात घेता, IZUMO1 किंवा JUNO ला बांधण्यासाठी पूर्वीच्या क्षमतेची चाचणी घेण्यात आली.बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (BLI) ही गतिज-आधारित बंधनकारक पद्धत आहे जी पूर्वी IZUMO1 आणि JUNO मधील परस्परसंवादाचे प्रमाण निश्चित करण्यासाठी वापरली गेली आहे.IZUMO1 सह बायोटिन-लेबल केलेल्या सेन्सरला JUNO विश्लेषकांच्या उच्च एकाग्रतेसह आमिष म्हणून उष्मायन केल्यानंतर, एक मजबूत सिग्नल आढळला (Fig. S14a), जो सेन्सरच्या टीपला जोडलेल्या बायोमटेरियलच्या जाडीमध्ये बंधनकारक-प्रेरित बदल दर्शवितो.तत्सम सिग्नल (म्हणजे, IZUMO1 विश्लेषक विरुद्ध आमिष म्हणून सेन्सरशी जोडलेले JUNO) (Fig. S14b).SPACA6 चा वापर सेन्सर-बाउंड IZUMO1 किंवा सेन्सर-बाउंड JUNO (आकृती S14a,b) विरुद्ध विश्लेषक म्हणून केला गेला तेव्हा कोणताही सिग्नल आढळला नाही.या सिग्नलची अनुपस्थिती सूचित करते की SPACA6 चे बाह्य सेल्युलर डोमेन IZUMO1 किंवा JUNO च्या बाह्य सेल्युलर डोमेनशी संवाद साधत नाही.
BLI परख हे प्रलोभन प्रोटीनवरील मुक्त लाइसिन अवशेषांच्या बायोटिनाइलेशनवर आधारित असल्यामुळे, जर लायसिन अवशेष परस्परसंवादात गुंतलेले असतील तर हे बदल बंधन टाळू शकतात.याव्यतिरिक्त, सेन्सरच्या सापेक्ष बाइंडिंगचे अभिमुखता स्टेरिक अडथळे निर्माण करू शकते, म्हणून पारंपारिक पुल-डाउन ऍसेस रीकॉम्बिनंट SPACA6, IZUMO1 आणि JUNO ectodomains वर देखील केले गेले.असे असूनही, SPACA6 हिस-टॅग केलेले IZUMO1 किंवा हिज-टॅग केलेले JUNO (Fig. S14c,d) सह प्रक्षेपित झाले नाही, जे BLI प्रयोगांमध्ये आढळलेल्या कोणत्याही परस्परसंवादाशी सुसंगत नसल्याचे दर्शविते.सकारात्मक नियंत्रण म्हणून, आम्ही JUNO च्या त्याच्या IZUMO1 (आकडे S14e आणि S15) लेबल असलेल्या परस्परसंवादाची पुष्टी केली.
SPACA6 आणि IZUMO1 मधील संरचनात्मक समानता असूनही, SPACA6 ची JUNO ला बांधण्याची असमर्थता आश्चर्यकारक नाही.मानवी IZUMO1 च्या पृष्ठभागावर 20 पेक्षा जास्त अवशेष आहेत जे JUNO शी संवाद साधतात, ज्यामध्ये प्रत्येक तीन प्रदेशातील अवशेषांचा समावेश आहे (जरी त्यापैकी बहुतेक बिजागर प्रदेशात स्थित आहेत) (चित्र S14f).या अवशेषांपैकी, फक्त एक SPACA6 (Glu70) मध्ये संरक्षित आहे.अनेक अवशेष प्रतिस्थापनांनी त्यांचे मूळ जैवरासायनिक गुणधर्म राखले असताना, IZUMO1 मधील अत्यावश्यक Arg160 अवशेष SPACA6 मधील नकारात्मक चार्ज केलेल्या Asp148 ने बदलले;मागील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की IZUMO1 मधील Arg160Glu उत्परिवर्तन JUNO43 चे बंधन जवळजवळ पूर्णपणे रद्द करते.याव्यतिरिक्त, IZUMO1 आणि SPACA6 मधील डोमेन अभिमुखतेतील फरकाने SPACA6 (Fig. S14g) वरील समतुल्य क्षेत्राच्या JUNO-बाइंडिंग साइटच्या पृष्ठभागाच्या क्षेत्रामध्ये लक्षणीय वाढ केली आहे.
गेमेट फ्यूजनसाठी SPACA6 ची ज्ञात गरज आणि IZUMO1 ची समानता असूनही, SPACA6 चे समतुल्य JUNO बंधनकारक कार्य असल्याचे दिसत नाही.म्हणून, आम्ही उत्क्रांतीवादी जीवशास्त्राने दिलेल्या महत्त्वाच्या पुराव्यासह आमचा संरचनात्मक डेटा एकत्र करण्याचा प्रयत्न केला आहे.SPACA6 homologues चे अनुक्रम संरेखन सस्तन प्राण्यांच्या पलीकडे असलेल्या सामान्य संरचनेचे संवर्धन दर्शविते.उदाहरणार्थ, सिस्टीनचे अवशेष अगदी दूरच्या संबंधित उभयचरांमध्ये देखील असतात (चित्र 6a).ConSurf सर्व्हरचा वापर करून, SPACA6 पृष्ठभागावर 66 अनुक्रमांचे एकाधिक अनुक्रम संरेखन धारणा डेटा मॅप केला गेला.या प्रकारचे विश्लेषण हे दर्शवू शकते की प्रथिने उत्क्रांती दरम्यान कोणते अवशेष संरक्षित केले गेले आहेत आणि कोणत्या पृष्ठभागाच्या कार्यामध्ये भूमिका बजावतात हे सूचित करू शकतात.
CLUSTAL OMEGA वापरून तयार केलेल्या 12 विविध प्रजातींमधून SPACA6 ectodomains चे अनुक्रम संरेखन.Consurf विश्लेषणानुसार, सर्वात पुराणमतवादी पोझिशन्स निळ्या रंगात चिन्हांकित आहेत.सिस्टीनचे अवशेष लाल रंगात हायलाइट केले जातात.डोमेन सीमा आणि दुय्यम संरचना घटक संरेखनाच्या शीर्षस्थानी दर्शविल्या जातात, जेथे बाण β-स्ट्रँड दर्शवतात आणि लाटा हेलिकेस दर्शवतात.सीक्वेन्स असलेले NCBI ऍक्सेस आयडेंटिफायर हे आहेत: मानव (होमो सेपियन्स, NP_001303901), मँड्रिल (मँड्रिलस ल्युकोफेयस, XP_011821277), कॅपचिन माकड (सेबस मिमिक, XP_01735936), ca201735936 घोडा, ca201360, caballus व्हेल (Orcinus orca3_23 XP_032_034) .), मेंढ्या (ओव्हिस मेष, XP_014955560), हत्ती (Loxodonta africana, XP_010585293), कुत्रा (Canis lupus familyis, XP_025277208), उंदीर (Mus musculus, NP_001155560), XP_001555638, XP_001555638, उंदीर 611, XP_0318), प्लॅटिपस, 8) , 61_89 आणि बुलफ्रॉग (Bufo bufo, XP_040282113).क्रमांकन मानवी क्रमावर आधारित आहे.b शीर्षस्थानी 4HB सह SPACA6 संरचनेचे पृष्ठभाग प्रतिनिधित्व आणि तळाशी Ig-सारखे डोमेन, ConSurf सर्व्हरच्या संवर्धन अंदाजांवर आधारित रंग.सर्वोत्कृष्ट जतन केलेले भाग निळ्या रंगात आहेत, माफक प्रमाणात संरक्षित केलेले भाग पांढऱ्या रंगात आहेत आणि सर्वात कमी संरक्षित भाग पिवळ्या रंगात आहेत.जांभळा सिस्टीन.उच्च पातळीचे संरक्षण दर्शवणारे तीन पृष्ठभाग पॅचेस 1, 2 आणि 3 लेबल केलेल्या इनसेटमध्ये दर्शविले आहेत. एक 4HB कार्टून शीर्षस्थानी उजवीकडे (समान रंग योजना) इनसेटमध्ये दर्शविले आहे.
SPACA6 संरचनेत तीन अत्यंत संरक्षित पृष्ठभाग आहेत (चित्र 6b).पॅच 1 4HB आणि बिजागर क्षेत्रापर्यंत पसरतो आणि त्यात दोन संरक्षित CXXC डायसल्फाइड ब्रिज, एक Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 बिजागर नेटवर्क (Fig. S7), आणि तीन संरक्षित बाह्य सुगंधी अवशेष (Phe31, Tyr137, Phe31) आहेत.Ig-सदृश डोमेन (Fig. S6e) चा एक विस्तीर्ण किनारा, जो शुक्राणूंच्या पृष्ठभागावर अनेक सकारात्मक चार्ज केलेले अवशेष दर्शवितो.विशेष म्हणजे, या पॅचमध्ये एक अँटीबॉडी एपिटोप आहे जो पूर्वी SPACA6 30 फंक्शनमध्ये हस्तक्षेप करत असल्याचे दर्शविले गेले आहे.प्रदेश 3 हा बिजागर आणि Ig-सारख्या डोमेनच्या एका बाजूला पसरलेला आहे;या प्रदेशात संरक्षित प्रोलाइन्स (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) आणि बाह्यमुखी ध्रुवीय/चार्ज केलेले अवशेष आहेत.आश्चर्याची गोष्ट म्हणजे, 4HB च्या पृष्ठभागावरील बहुतेक अवशेष अत्यंत परिवर्तनशील आहेत (Fig. 6b), जरी पट SPACA6 homologue मध्ये संरक्षित आहे (जसे हायड्रोफोबिक बंडल कोरच्या रूढीवादाने सूचित केले आहे) आणि IST सुपरफॅमिलीच्या पलीकडे.
जरी हे SPACA6 मधील सर्वात कमी शोधण्यायोग्य दुय्यम संरचना घटकांसह सर्वात लहान क्षेत्र असले तरी, अनेक बिजागर क्षेत्राचे अवशेष (क्षेत्र 3 सह) SPACA6 समलैंगिकांमध्ये अत्यंत संरक्षित आहेत, जे हे सूचित करू शकतात की हेलिकल बंडल आणि β-सँडविचची अभिमुखता भूमिका बजावते.एक पुराणमतवादी म्हणून.तथापि, SPACA6 आणि IZUMO1 च्या बिजागर प्रदेशात विस्तृत हायड्रोजन बाँडिंग आणि इलेक्ट्रोस्टॅटिक नेटवर्क असूनही, IZUMO137,43,44 च्या एकाधिक अनुमत संरचनांच्या संरेखनमध्ये आंतरिक लवचिकतेचा पुरावा दिसू शकतो.वैयक्तिक डोमेनचे संरेखन चांगले ओव्हरलॅप झाले, परंतु एकमेकांशी संबंधित डोमेनचे अभिमुखता मध्य अक्षापासून 50° ते 70° पर्यंत बदलते (चित्र S16).सोल्यूशनमधील SPACA6 ची रचनात्मक गतिशीलता समजून घेण्यासाठी, SAXS प्रयोग केले गेले (Fig. S17a,b).SPACA6 ectodomain ची प्रारंभिक पुनर्रचना रॉड क्रिस्टल स्ट्रक्चर (Fig. S18) च्या अनुरूप आहे, जरी Kratky प्लॉटने काही प्रमाणात लवचिकता दर्शविली (Fig. S17b).ही रचना IZUMO1 शी विरोधाभास आहे, ज्यामध्ये अनबाउंड प्रथिने जाळीमध्ये आणि द्रावणात बूमरॅंग आकार धारण करते.
विशेषत: लवचिक प्रदेश ओळखण्यासाठी, हायड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोस्कोपी (H-DXMS) SPACA6 वर केली गेली आणि IZUMO143 (Fig. 7a,b) वर पूर्वी मिळवलेल्या डेटाशी तुलना केली.SPACA6 हे IZUMO1 पेक्षा स्पष्टपणे अधिक लवचिक आहे, 100,000 s एक्सचेंज नंतर संपूर्ण संरचनेत उच्च ड्युटेरियम एक्सचेंजद्वारे सूचित केले जाते.दोन्ही संरचनांमध्ये, बिजागर क्षेत्राचा C-टर्मिनल भाग उच्च पातळीची देवाणघेवाण दर्शवितो, जो कदाचित 4HB आणि Ig-सारखी डोमेन एकमेकांच्या सापेक्ष मर्यादित रोटेशनला अनुमती देतो.विशेष म्हणजे, SPACA6 बिजागराचा C-टर्मिनल भाग, ज्यामध्ये 147CDLPLDCP154 अवशेषांचा समावेश आहे, हा एक अत्यंत संरक्षित प्रदेश 3 (Fig. 6b) आहे, शक्यतो इंटरडोमेन लवचिकता हे SPACA6 चे उत्क्रांतीपूर्वक संरक्षित वैशिष्ट्य असल्याचे दर्शविते.लवचिकता विश्लेषणानुसार, CD थर्मल मेल्ट डेटाने दर्शविले की SPACA6 (Tm = 51.2°C) IZUMO1 (Tm = 62.9°C) (Fig. S1e आणि S19) पेक्षा कमी स्थिर आहे.
SPACA6 आणि b IZUMO1 च्या H-DXMS प्रतिमा.ड्युटेरियम एक्सचेंजची टक्केवारी सूचित वेळेच्या बिंदूंवर निर्धारित केली गेली.हायड्रोजन-ड्युटेरियम एक्सचेंजची पातळी निळ्या (10%) ते लाल (90%) पर्यंत ग्रेडियंट स्केलवर रंगाद्वारे दर्शविली जाते.ब्लॅक बॉक्स उच्च विनिमय क्षेत्राचे प्रतिनिधित्व करतात.क्रिस्टल स्ट्रक्चरमध्ये 4HB, बिजागर आणि Ig-सारख्या डोमेनच्या सीमा प्राथमिक क्रमाच्या वर दर्शविल्या जातात.10 s, 1000 s, आणि 100,000 s वर ड्युटेरियम विनिमय पातळी SPACA6 आणि IZUMO1 च्या पारदर्शक आण्विक पृष्ठभागांवर सुपरइम्पोज केलेल्या स्ट्रिप चार्टवर प्लॉट केल्या होत्या.ड्युटेरियम एक्सचेंज लेव्हल 50% पेक्षा कमी असलेल्या संरचनेचे भाग रंगीत पांढरे आहेत.50% H-DXMS एक्सचेंज वरील क्षेत्र ग्रेडियंट स्केलमध्ये रंगीत आहेत.
CRISPR/Cas9 आणि माऊस जनुक नॉकआउट आनुवंशिक धोरणांच्या वापरामुळे शुक्राणू आणि अंडी बंधनकारक आणि संलयनासाठी महत्त्वाचे घटक ओळखले गेले आहेत.IZUMO1-JUNO आणि CD9 संरचनेच्या चांगल्या-वैशिष्ट्यपूर्ण परस्परसंवादाव्यतिरिक्त, गेमेट फ्यूजनशी संबंधित बहुतेक प्रथिने संरचनात्मक आणि कार्यात्मकदृष्ट्या रहस्यमय राहतात.SPACA6 चे बायोफिजिकल आणि स्ट्रक्चरल कॅरेक्टरायझेशन हे फर्टिलायझेशन दरम्यान आसंजन/फ्यूजन आण्विक कोडेचा आणखी एक भाग आहे.
SPACA6 आणि IST चे इतर सदस्य सस्तन प्राण्यांमध्ये तसेच वैयक्तिक पक्षी, सरपटणारे प्राणी आणि उभयचरांमध्ये अत्यंत संरक्षित असल्याचे दिसून येते;खरं तर, असे मानले जाते की झेब्राफिश 59 मध्ये गर्भाधानासाठी SPACA6 देखील आवश्यक आहे. हे वितरण DCST134, DCST234, FIMP31, आणि SOF132 सारख्या ज्ञात गेमेट फ्यूजन-संबंधित प्रथिनेंसारखेच आहे, हे सूचित करते की हे घटक HAP2-ची कमतरता आहेत (तसेच GCS1) प्रथिने म्हणून ओळखले जातात जे अनेक प्रोटिस्टच्या उत्प्रेरक क्रियाकलापांसाठी जबाबदार असतात., वनस्पती आणि आर्थ्रोपॉड्स.निषेचित फ्यूजन प्रथिने 60, 61. SPACA6 आणि IZUMO1 मधील मजबूत संरचनात्मक समानता असूनही, यापैकी कोणत्याही प्रथिनांच्या एन्कोडिंग जनुकांच्या नॉकआउटमुळे नर उंदरांमध्ये वंध्यत्व आले, हे दर्शविते की गेमेट फ्यूजनमधील त्यांची कार्ये डुप्लिकेट केलेली नाहीत..अधिक व्यापकपणे, फ्यूजनच्या आसंजन टप्प्यासाठी आवश्यक असलेले कोणतेही ज्ञात शुक्राणू प्रथिने अनावश्यक नाहीत.
SPACA6 (आणि IST सुपरफॅमिलीचे इतर सदस्य) इंटरगॅमेटिक जंक्शन्समध्ये भाग घेतात, फ्यूजन पॉइंट्समध्ये महत्त्वाच्या प्रथिनांची भरती करण्यासाठी इंट्रागॅमेटिक नेटवर्क तयार करतात किंवा कदाचित मायावी फ्यूसोजेन म्हणून देखील कार्य करतात का हा एक खुला प्रश्न आहे.HEK293T पेशींमधील सह-इम्युनोप्रीसीपीटेशन अभ्यासातून संपूर्ण लांबीच्या IZUMO1 आणि SPACA632 मधील परस्परसंवाद दिसून आला.तथापि, आमच्या रीकॉम्बिनंट एक्टोडोमेनने विट्रोमध्ये संवाद साधला नाही, जे सूचित करते की नोडा एट अल मध्ये पाहिलेले परस्परसंवाद.रचनेमध्ये दोन्ही हटवले गेले (IZUMO1 ची सायटोप्लाज्मिक शेपटी लक्षात घ्या, जी गर्भाधानासाठी अनावश्यक असल्याचे दर्शविले गेले आहे62).वैकल्पिकरित्या, IZUMO1 आणि/किंवा SPACA6 ला विशिष्ट बंधनकारक वातावरणाची आवश्यकता असू शकते जी आम्ही विट्रोमध्ये पुनरुत्पादित करत नाही, जसे की शारीरिकदृष्ट्या विशिष्ट रचना किंवा इतर प्रथिने असलेले आण्विक कॉम्प्लेक्स (ज्ञात किंवा अद्याप सापडलेले नाहीत).जरी IZUMO1 एक्टोडोमेन पेरिव्हिटेललाइन स्पेसमध्ये शुक्राणूजन्य अंडीला जोडण्यासाठी मध्यस्थी करते असे मानले जात असले तरी, SPACA6 एक्टोडोमेनचा उद्देश अस्पष्ट आहे.
SPACA6 ची रचना अनेक संरक्षित पृष्ठभाग प्रकट करते जे प्रथिने-प्रोटीन परस्परसंवादात सामील असू शकतात.CXXC मोटिफ (वर नियुक्त पॅच 1) च्या लगत असलेल्या बिजागर क्षेत्राच्या संरक्षित भागामध्ये अनेक बाह्य-मुखी सुगंधी अवशेष आहेत जे बहुतेकदा बायोमोलेक्यूल्समधील हायड्रोफोबिक आणि π-स्टॅकिंग परस्परसंवादाशी संबंधित असतात.Ig-सदृश डोमेन (क्षेत्र 2) च्या विस्तृत बाजू अत्यंत संरक्षित Arg आणि त्याच्या अवशेषांसह सकारात्मक चार्ज केलेले खोबणी बनवतात आणि या प्रदेशाविरूद्ध प्रतिपिंडांचा वापर गेमेट फ्यूजन 30 अवरोधित करण्यासाठी पूर्वी केला गेला आहे.अँटीबॉडी रेखीय एपिटोप 212RIRPQLTHRGTFS225 ओळखते, ज्यामध्ये सहा पैकी तीन आर्जिनिन अवशेष आहेत आणि हिस220 अत्यंत संरक्षित आहे.हे बिघडलेले कार्य या विशिष्ट अवशेषांच्या अडथळ्यामुळे होते की संपूर्ण प्रदेशात हे स्पष्ट नाही.β-सँडविचच्या C-टर्मिनसजवळील या अंतराचे स्थान शेजारच्या शुक्राणूंच्या प्रथिनांसह cis-संवाद दर्शवते, परंतु oocyte प्रथिनांसह नाही.शिवाय, बिजागराच्या आत अत्यंत लवचिक प्रोलाइन-समृद्ध टँगल (साइट 3) ची धारणा प्रोटीन-प्रोटीन परस्परसंवादाची साइट असू शकते किंवा बहुधा, दोन डोमेनमधील लवचिकता टिकवून ठेवण्याचे संकेत देते.SPACA6 च्या अज्ञात भूमिकेसाठी लिंग महत्त्वाचे आहे.गेमेट्सचे संलयन.
SPACA6 मध्ये इंटरसेल्युलर आसंजन प्रथिनांचे गुणधर्म आहेत, ज्यामध्ये Ig-सारख्या β-सँडविचचा समावेश आहे.अनेक चिकट प्रथिने (उदा., cadherins, integrins, adhesins आणि IZUMO1) मध्ये एक किंवा अधिक β-सँडविच डोमेन असतात जे प्रथिने सेल झिल्लीपासून त्यांच्या पर्यावरणीय लक्ष्यांपर्यंत विस्तारित करतात.SPACA6 च्या Ig-सदृश डोमेनमध्ये β-सँडविचमध्ये सामान्यतः आढळणारा एक आकृतिबंध देखील असतो: β-सँडविचच्या शेवटी समांतर स्ट्रँडचे दुहेरी, ज्याला यांत्रिक clamps66 म्हणतात.असे मानले जाते की हे आकृतिबंध कातरणे शक्तींना प्रतिकार वाढवते, जे इंटरसेल्युलर परस्परसंवादामध्ये गुंतलेल्या प्रथिनांसाठी मौल्यवान आहे.तथापि, अॅडेसिन्सशी हे समानता असूनही, सध्या असा कोणताही पुरावा नाही की SPACA6 अंड्याच्या पांढर्याशी संवाद साधतो.SPACA6 ectodomain JUNO ला बांधण्यात अक्षम आहे, आणि SPACA6- व्यक्त करणार्‍या HEK293T पेशी, येथे दाखवल्याप्रमाणे, zona 32 नसलेल्या oocytes सोबत क्वचितच संवाद साधतात.जर SPACA6 ने इंटरगॅमेटिक बॉन्ड्स स्थापित केले, तर या परस्परसंवादांना इतर शुक्राणूंच्या प्रथिनेंद्वारे अनुवादानंतरचे बदल किंवा स्थिरीकरण आवश्यक असू शकते.नंतरच्या गृहीतकाच्या समर्थनार्थ, IZUMO1-अभावी शुक्राणूजन्य oocytes ला बांधतात, हे दर्शविते की IZUMO1 व्यतिरिक्त इतर रेणू गेमेट आसंजन चरण 27 मध्ये सामील आहेत.
अनेक व्हायरल, सेल्युलर आणि डेव्हलपमेंटल फ्यूजन प्रोटीन्समध्ये असे गुणधर्म असतात जे फ्यूसोजेन म्हणून त्यांच्या कार्याचा अंदाज लावतात.उदाहरणार्थ, व्हायरल फ्यूजन ग्लायकोप्रोटीन्स (वर्ग I, II आणि III) मध्ये प्रथिनांच्या शेवटी हायड्रोफोबिक फ्यूजन पेप्टाइड किंवा लूप असतो जो होस्ट झिल्लीमध्ये घातला जातो.IZUMO143 चा हायड्रोफिलिसिटी नकाशा आणि IST ची रचना (निर्धारित आणि अंदाज) सुपरफॅमिलीने कोणतेही स्पष्ट हायड्रोफोबिक फ्यूजन पेप्टाइड दाखवले नाही.अशाप्रकारे, IST मधील कोणतेही प्रथिने सुपरफॅमिली फ्यूसोजेन म्हणून कार्य करत असल्यास, ते इतर ज्ञात उदाहरणांपेक्षा वेगळ्या पद्धतीने करतात.
शेवटी, गेमेट फ्यूजनशी संबंधित प्रथिनांच्या सुपरफॅमिली IST च्या सदस्यांची कार्ये एक रहस्यमय गूढ राहतील.आमचे वैशिष्ट्यीकृत SPACA6 रीकॉम्बिनंट रेणू आणि त्याची निराकरण केलेली रचना या सामायिक संरचनांमधील संबंध आणि गेमेट संलग्नक आणि फ्यूजनमधील त्यांच्या भूमिकेबद्दल अंतर्दृष्टी प्रदान करेल.
अंदाजित मानवी SPACA6 एक्टोडोमेन (NCBI प्रवेश क्रमांक NP_001303901.1; अवशेष 27-246) शी संबंधित DNA अनुक्रम ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर S2 पेशींमध्ये अभिव्यक्तीसाठी कोडोन-ऑप्टिमाइझ केले गेले होते आणि जीन-इक्वोक्नोजॅमिक जीन-इक्वोजेन्स फ्रॅगमेंटसह संश्लेषित केले गेले होते., BiP स्राव सिग्नल आणि संबंधित 5′ आणि 3′ प्युरोमायसिन (pMT-puro) सह निवडीसाठी सुधारित मेटॅलोथिओनिन प्रमोटरवर आधारित या जनुकाच्या pMT अभिव्यक्ती वेक्टरमध्ये बंधन-स्वतंत्र क्लोनिंगसाठी समाप्त होते.पीएमटी-पुरो वेक्टर थ्रॉम्बिन क्लीवेज साइट एन्कोड करतो आणि त्यानंतर 10x-हिस सी-टर्मिनल टॅग (आकृती S2) असतो.
SPACA6 pMT-puro वेक्टरचे D. melanogaster S2 (Gibco) पेशींमध्ये स्थिर संक्रमण IZUMO1 आणि JUNO43 साठी वापरलेल्या प्रोटोकॉलप्रमाणेच केले गेले.S2 पेशी वितळल्या आणि श्नाइडरच्या माध्यमात वाढल्या (Gibco) 10% (v/v) उष्मा-निष्क्रिय गर्भाच्या वासराच्या सीरम (Gibco) आणि 1X अँटीमायकोटिक प्रतिजैविक (Gibco) च्या अंतिम एकाग्रतेसह पूरक.अर्ली पॅसेज सेल (3.0 x 106 सेल) 6-वेल प्लेट्सच्या (कॉर्निंग) वैयक्तिक विहिरींमध्ये प्लेटेड केले गेले.27 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 24 तासांच्या उष्मायनानंतर, उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलनुसार SPACA6 pMT-puro व्हेक्टर आणि Effectene transfection reagent (Qiagen) च्या 2 mg च्या मिश्रणाने पेशींचे संक्रमण होते.संक्रमण झालेल्या पेशी 72 तास उबवल्या गेल्या आणि नंतर 6 मिलीग्राम/मिली प्युरोमायसिनने कापणी केली.नंतर पेशी पूर्ण श्नाइडरच्या माध्यमापासून वेगळ्या केल्या गेल्या आणि मोठ्या प्रमाणात प्रथिने उत्पादनासाठी सीरम मुक्त कीटक-एक्सप्रेस माध्यम (लोन्झा) मध्ये ठेवल्या गेल्या.S2 सेल कल्चरची 1 L बॅच 8-10 × 106 ml-1 पेशींमध्ये 2 L हवेशीर फ्लॅट-बॉटम पॉलीप्रॉपिलीन एर्लेनमेयर फ्लास्कमध्ये वाढविली गेली आणि नंतर 500 μM CuSO4 (मिलीपोर सिग्मा) आणि निर्जंतुकीकरण केलेल्या अंतिम एकाग्रतेसह निर्जंतुकीकरण केले गेले.प्रेरित.प्रेरित संस्कृतींना 27° से. तापमानात 120 rpm वर चार दिवस उष्मायन करण्यात आले.
SPACA6 असलेले कंडिशन केलेले माध्यम 5660×g वर 4°C वर सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे वेगळे केले गेले आणि त्यानंतर 10 kDa MWCO झिल्लीसह सेंट्रमेट टॅन्जेंशियल फ्लो फिल्टरेशन सिस्टम (पॉल कॉर्प) द्वारे वेगळे केले गेले.SPACA6 असलेले केंद्रित माध्यम 2 ml Ni-NTA agarose resin (Qiagen) स्तंभावर लावा.Ni-NTA राळ बफर A च्या 10 कॉलम व्हॉल्यूम (CV) सह धुतले गेले आणि नंतर 50 mM चे अंतिम इमिडाझोल एकाग्रता देण्यासाठी बफर A चे 1 CV जोडले गेले.SPACA6 ला 10 मिली बफर A च्या सहाय्याने इमिडाझोलसह पूरक 500 mM च्या अंतिम एकाग्रतेने तयार केले गेले.डायलिसिस ट्युबिंग (MWCO 12-14 kDa) मध्ये 1 युनिट प्रति mg SPACA6 विरुद्ध 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 आणि 150 mM NaCl (बफर B) डायलिसिस टयूबिंगमध्ये प्रतिबंधित वर्ग थ्रोम्बिन (मिलीपूर सिग्मा) थेट जोडला गेला.) ४८ तासांसाठी ४°C वर.थ्रॉम्बिन-क्लीव्ह केलेले SPACA6 नंतर मीठ एकाग्रता कमी करण्यासाठी तीन पटीने पातळ केले गेले आणि 10 mm Tris-HCl, pH 7.5 सह समतोल असलेल्या 1 मिली मोनोएस 5/50 GL केशन एक्सचेंज कॉलम (सायटिव्हा/जीई) वर लोड केले गेले.कॅशन एक्सचेंजर 3 ओके 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5 ने धुतले गेले, त्यानंतर 25 ओकेसाठी 10 एमएम ट्रिस-एचसीएलमध्ये 0 ते 500 मिमी NaCl पर्यंत रेखीय ग्रेडियंटसह एसपीएसीए6, पीएच 7.5 प्रमाणे एल्युट केले गेले.आयन एक्सचेंज क्रोमॅटोग्राफीनंतर, SPACA6 1 ml वर केंद्रित केले गेले आणि बफर B सह समतोल असलेल्या ENrich SEC650 10 x 300 स्तंभ (BioRad) मधून isocratically eluted. क्रोमॅटोग्रामनुसार, SPACA6 असलेले पूल आणि सांद्रित अपूर्णांक.16% SDS-polyacrylamide gel वर Coomassie-stained electrophoresis द्वारे शुद्धता नियंत्रित केली गेली.बीअर-लॅम्बर्ट कायदा आणि सैद्धांतिक मोलर विलोपन गुणांक वापरून 280 एनएम शोषून प्रथिने एकाग्रतेचे प्रमाण निश्चित केले गेले.
शुद्ध SPACA6 चे 10 mM सोडियम फॉस्फेट, pH 7.4 आणि 150 mM NaF विरुद्ध रात्रभर डायलायझ केले गेले आणि CD स्पेक्ट्रोस्कोपीद्वारे विश्लेषण करण्यापूर्वी ते 0.16 mg/mL पर्यंत पातळ केले गेले.185 ते 260 nm तरंगलांबी असलेल्या CD चे स्पेक्ट्रल स्कॅनिंग 50 nm/min च्या दराने 25°C वर 1 मिमी ऑप्टिकल पथ लांबी (हेल्मा) सह क्वार्ट्ज क्युवेट्स वापरून Jasco J-1500 स्पेक्ट्रोपोलारिमीटरवर गोळा केले गेले.सीडी स्पेक्ट्रा बेसलाइन दुरुस्त केले गेले, सरासरी 10 पेक्षा जास्त संपादन केले गेले आणि अंश cm2/dmol मध्ये अवशिष्ट लंबवर्तुळ (θMRE) मध्ये रूपांतरित केले:
जेथे MW हे Da मधील प्रत्येक नमुन्याचे आण्विक वजन आहे;एन ही एमिनो ऍसिडची संख्या आहे;θ मिलिडीग्रीमध्ये लंबवर्तुळ आहे;d cm मध्ये ऑप्टिकल मार्गाच्या लांबीशी संबंधित आहे;युनिट्समध्ये प्रथिने एकाग्रता.