310 10*1mm स्टेनलेस स्टील कॉइल केलेले टयूबिंग रासायनिक घटक ,स्पायड्रोइनचे एन-टर्मिनल डोमेन अॅमिलॉइड फायब्रिल्सवर आधारित हायड्रोजेल तयार करतात आणि प्रथिने स्थिर करण्यासाठी एक व्यासपीठ प्रदान करतात.

Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद.तुम्ही मर्यादित CSS समर्थनासह ब्राउझर आवृत्ती वापरत आहात.सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये सुसंगतता मोड अक्षम करा).याव्यतिरिक्त, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही शैली आणि JavaScript शिवाय साइट दर्शवतो.
प्रति स्लाइड तीन लेख दर्शवणारे स्लाइडर.स्लाइड्समधून जाण्यासाठी मागील आणि पुढील बटणे वापरा किंवा प्रत्येक स्लाइडमधून जाण्यासाठी शेवटी स्लाइड कंट्रोलर बटणे वापरा.

तपशील

310 10*1mm स्टेनलेस स्टील कॉइल केलेले ट्यूबिंग पुरवठादार

रासायनिक रचना

यांत्रिक गुणधर्म

नवीन बायोमटेरियल्सच्या विकासामध्ये रीकॉम्बीनंट स्पायडर सिल्क प्रोटीन्स (स्पायडर सिल्क प्रोटीन्स) चे अनेक संभाव्य उपयोग आहेत, परंतु त्यांच्या बहुविध आणि एकत्रीकरण-प्रवण स्वभावामुळे ते मिळवणे कठीण आणि वापरण्यास सोपे आहे.येथे आम्ही नोंदवतो की रीकॉम्बीनंट सूक्ष्म स्पिड्रोइन प्रथिने आणि महत्त्वाचे म्हणजे, एन-टर्मिनल डोमेन (NT) स्वतःच 37 डिग्री सेल्सिअस तापमानात स्वयं-समर्थक आणि पारदर्शक हायड्रोजेल तयार करतात.एनटी आणि ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन किंवा प्युरिन न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरिलेज असलेले फ्यूजन प्रोटीन पूर्णतः कार्यशील फ्यूजन प्रोटीन बनवतात.हायड्रोजेल्स.आमचे परिणाम असे दर्शवतात की रीकॉम्बिनंट NT आणि फ्यूजन प्रोटीन्स उच्च अभिव्यक्ती उत्पन्न देतात आणि हायड्रोजेलला आकर्षक गुणधर्म देतात जसे की पारदर्शकता, क्रॉसलिंकिंगशिवाय जेलेशन आणि उच्च घनतेवर सक्रिय प्रथिनांचे थेट स्थिरीकरण.
कोळीमध्ये रेशीम ग्रंथींचे तब्बल सात वेगवेगळे संच असतात, प्रत्येक विशिष्ट प्रकारचे रेशीम तयार करतात.सर्व सात रेशीम प्रजाती स्पायडर सिल्क प्रथिने (स्पिड्रोइन्स) सुमारे 6000 अवशेषांनी बनलेल्या आहेत आणि त्यामध्ये गोलाकार N- आणि C-टर्मिनल डोमेन (NT आणि CT) 1,2 ने वेढलेला एक मोठा मध्यवर्ती पुनरावृत्ती प्रदेश आहे.रेशीमचा सर्वात व्यापकपणे अभ्यास केलेला प्रकार, प्राथमिक एम्पुला, प्राथमिक एम्पुला ग्रंथीद्वारे तयार केला जातो.या ग्रंथीमध्ये, एपिथेलियल पेशींचा एक मोनोलेयर स्पायड्रोइन प्रथिनांचे संश्लेषण करतो आणि त्यांना ग्रंथीच्या लुमेनमध्ये स्रावित करतो, जेथे ते अत्यंत उच्च सांद्रता (30-50% w/v) 3,4 मध्ये विद्रव्य स्वरूपात (डोपिंग) असतात.ग्रंथीमधील मुख्य एम्प्युलर स्पिड्रॉइन प्रथिनांचे संघटन आणि रचना यावर वादविवाद केला गेला आहे, परंतु बहुतेक प्रायोगिक पुरावे सामान्यतः हेलिकल आणि/किंवा यादृच्छिक हेलिकल रचना आणि मायसेलर किंवा लॅमेलर संरचना 5,6,7,8,9,10 ची उपस्थिती दर्शवतात.पुनरावृत्ती होणारे डोमेन रेशीम तंतूंच्या यांत्रिक गुणधर्मांचे नियमन करतात, β-शीट नॅनोक्रिस्टल्स आणि आकारहीन संरचना बनवतात, 11,12,13,14,15, अंतिम डोमेन रेशीम ग्रंथी 16,17,18 च्या बाजूने बदलणाऱ्या परिस्थितीच्या प्रतिसादात रेशीम तंतूंचे नियमन करतात.रेशीम निर्मिती नियंत्रित करून, 19. टर्मिनल डोमेन्स उत्क्रांतीनुसार संरक्षित केले जातात आणि त्यांचे कार्य सर्व स्पायड्रोइन प्रथिने 2,20,21 मध्ये सामान्य असू शकते.ग्रंथीतून जाताना, स्पिड्रॉइनचा pH सुमारे 7.6 ते <5.716 पर्यंत कमी होतो आणि हळूहळू अरुंद होत असलेल्या नलिकाद्वारे हालचालींद्वारे मध्यस्थी करून कातरणे आणि ताणून वाढते.सोल्युशनमध्ये, CT हे α-हेलिकल कॉन्स्टिटिव्ह पॅरलल डायमर आहे 17, परंतु कमी pH आणि कातरणे फोर्सच्या प्रतिसादात, CT β-layers 16, 17 उलगडते आणि स्विच करते, शक्यतो कन्व्हर्ट 16 च्या पुनरावृत्ती झालेल्या प्रदेशांमध्ये β-स्तरांना चालना देते. NT हे मोनोमेरिक आहेत. ग्रंथीच्या लुमेनमधील परिस्थिती प्रतिबिंबित करणाऱ्या परिस्थिती आणि स्पिड्रॉइनच्या विद्राव्यतेमध्ये मध्यस्थी करतात, परंतु कमी pH वर, अनेक कार्बोक्झिलिक ऍसिड साईड चेनच्या प्रोटोनेशनमुळे सुमारे 6.5 च्या pKa सह NT चे डायमरायझेशन होते, ज्यामुळे NT स्थिर होते आणि मोठ्या प्रमाणात स्पिड्रोइन निश्चित होते. प्रमाणनेटवर्क 16,18.अशा प्रकारे, फिलामेंट निर्मितीमध्ये एनटी महत्त्वाची भूमिका बजावते, कोटिंगमधील मोनोमरपासून फायबर 23,24,25 मधील डायमरमध्ये बदलते.दिनांक 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29 पर्यंतचा अभ्यास केलेल्या सर्व परिस्थितीत NT अत्यंत विरघळणारे आणि हेलिकल राहते, ज्यामुळे विषम प्रथिनांच्या निर्मितीसाठी विद्राव्यता-वर्धक लेबल म्हणून त्याच्या विकासास प्रेरणा मिळाली.
रिकॉम्बिनंट मिनी स्पायडर रेशीम प्रथिने, ज्यामध्ये एक NT, एक लहान पुनरावृत्ती क्षेत्र, एक CT, आणि शुद्धीकरणासाठी His6 टॅग (His-NT2RepCT) आहे, हे जलीय बफरमध्ये मूळ स्पायडर रेशीम प्रथिनाइतके विरघळणारे आहे आणि रेशीम कोळ्याच्या मूळ वैशिष्ट्यांची नक्कल करते. .कव्हरेज 25.31.बायोमिमेटिक मशीन वापरून हिज-एनटी2आरपीसीटी सतत तंतूंमध्ये कातले जाऊ शकते ज्यामध्ये पीएच 8 विरघळणारे कोटिंग पीएच 525,32,33,34,35 वॉटर बाथमध्ये बाहेर काढले जाते.E. coli च्या बायोरिएक्टर किण्वनाने His-NT2RepCT व्यक्त केले आणि त्यानंतरच्या उपचारानंतर शुद्धीकरणानंतर 14 g/L उत्पादन मिळाले.उच्च उत्पन्न, उच्च विद्राव्यता आणि हिस-NT2RepCT चा अम्लीय स्थितीला पुरेसा प्रतिसाद हे सर्व NT23, 25, 34 यांना दिले जाते.
येथे आम्ही 37 डिग्री सेल्सिअस तापमानात प्रथिने द्रावण उष्मायन करून एकट्या एनटीसह रीकॉम्बिनंट स्पिड्रॉइन प्रथिनांपासून पारदर्शक हायड्रोजेलच्या जलद निर्मितीचा अहवाल देतो.थिओफ्लेविन टी फ्लूरोसेन्स (ThT), फूरियर ट्रान्सफॉर्म इन्फ्रारेड स्पेक्ट्रोस्कोपी (FTIR), न्यूक्लियर मॅग्नेटिक रेझोनान्स स्पेक्ट्रोस्कोपी (NMR) आणि ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी (TEM) वापरून, आम्हाला आढळले की NT आणि मायक्रोस्पायडर प्रथिने β-sheets आणि amyloid-सदृश फायबरमध्ये संरचनात्मक रूपांतर करतात. जेव्हा जेल तयार होतात.याव्यतिरिक्त, NT आणि ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) किंवा प्युरिन न्यूक्लिओसाइड फॉस्फोरिलेज (PNP) चे फ्यूजन प्रोटीन पूर्णपणे कार्यात्मक फ्यूजन तुकड्यांसह हायड्रोजेल तयार करतात.हेटरोलॉजस यजमानांमध्ये उच्च-थ्रूपुट अभिव्यक्ती, शारीरिक परिस्थितीत हायड्रोजेलच्या जलद निर्मितीसह, इंजिनियर केलेल्या कार्यांसह हायड्रोजेलच्या किफायतशीर उत्पादनाची शक्यता उघडते.
सर्वाधिक नोंदवलेल्या रीकॉम्बीनंट स्पिड्रॉइन प्रोटीन्सच्या विपरीत, His-NT2RepCT Tris-HCl बफरमध्ये pH 8 वर स्थिर आहे आणि वर्षाव न होता 500 mg/mL पर्यंत केंद्रित केले जाऊ शकते.म्हणून, आम्हाला हे पाहून आश्चर्य वाटले की हे प्रथिने 37°C (चित्र 1b-d) वर उष्मायन केल्यावर ऑप्टिकली स्पष्ट, स्व-समर्थक हायड्रोजेल वेगाने तयार होतात.पुढील अभ्यासातून असे दिसून आले की His-NT2RepCT गेलेशन प्रथिनांच्या एकाग्रतेच्या विस्तृत श्रेणीवर (10-300 mg/mL) झाले आणि ही एकाग्रता जिलेशन वेळेशी विपरितपणे सहसंबंधित होती (Fig. 1c आणि पूरक Fig. 1).His-NT2RepCT चे कोणते भाग हायड्रोजेल निर्मितीमध्ये मध्यस्थी करतात हे शोधण्यासाठी, आम्ही नंतर फ्लास्क इन्व्हर्शन परख (आकृती 1a,b) वापरून प्रत्येक डोमेनचे स्वतंत्रपणे आणि विविध संयोजनांमध्ये परीक्षण केले.रीकॉम्बीनंट स्पिड्रोइनचे सर्व चाचणी केलेले अपूर्णांक 1 तासापेक्षा कमी वेळेत जेल (300 mg/mL च्या प्रथिने एकाग्रतेवर) तयार करतात, 2Rep (Fig. 1b) वगळता.हे सूचित करते की एकट्या NT आणि CT, संयोगाने, किंवा पुनरावृत्तीशी संबंधित, 37°C वर जेल होऊ शकतात आणि His6 टॅग या प्रक्रियेवर कोणत्याही महत्त्वपूर्ण प्रमाणात परिणाम करत नाही.एनटी हे अत्यंत विरघळणारे आणि स्थिर प्रथिने आहे, आणि रीकॉम्बीनंट स्पिड्रॉइन हायड्रोजेलच्या मागील अहवालांमध्ये पुनरावृत्ती क्षेत्रांमध्ये आणि/किंवा सीटीमध्ये रचनात्मक बदलांना गेलेशन इफेक्ट्सचे श्रेय दिले आहे, हे लक्षात घेता, एनटी स्वतःच करू शकते.जिलेशनचा शोध अनपेक्षित होता.पूरक तक्ता 1) 37, 38, 39. उल्लेखनीय म्हणजे, NT ≥ 300 mg/mL (Fig. 1c) च्या एकाग्रतेने 10 मिनिटांच्या आत आधीच तयार झाले आहे.एनटीच्या विविध एकाग्रतेसह वायल इन्व्हर्शन प्रयोगांनी दर्शविले की 50 mg/mL वर NT सोल्यूशन हिस-NT2RepCT पेक्षा संबंधित एकाग्रता (w/v, आकृती 1c) पेक्षा अधिक वेगाने तयार होते.
या कामात अभ्यासलेल्या विविध स्पायड्रोइन रचनांचे योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व.b विविध रीकॉम्बीनंट स्पिड्रोइन प्रोटीन्स (300 mg/mL) साठी 37 °C वर जेलची वेळ कुपी उलटून सत्यापित केली जाते.उष्मायन न करता लगेच सीटी जेल (<300 mg/mL), 2Rep precipitates (300 mg/mL, 5 mm स्केल).c हिस-NT2RepCT आणि NT ची जेल वेळ 37°C वर सूचित प्रथिने एकाग्रतेवर.d हिज-NT2RepCT आणि NT हायड्रोजेलची छायाचित्रे कोळी आणि खाली छापलेले अक्षर "NT" अनुक्रमे (दोन्ही 200 mg/mL, स्केल बार 5 mm).
विविध रीकॉम्बिनंट स्पायड्रोइन प्रथिनेंद्वारे तयार झालेल्या हायड्रोजेल्सचे रंग थोडे वेगळे असतात आणि उघड्या डोळ्यांच्या निरीक्षणात वेगवेगळ्या प्रमाणात पारदर्शकता दिसून येते (चित्र 1b).एनटी जेल अपवादात्मकपणे स्पष्ट असतात तर इतर जेल अपारदर्शक बनतात.बेलनाकार नळ्यांमध्ये टाकलेले His-NT2RepCT आणि NT जेल अखंड साच्यातून काढले जाऊ शकतात (Fig. 1d).
नैसर्गिक स्पायडर सिल्क कोटिंग्जच्या जेलमुळे आता रिकॉम्बिनंट स्पायड्रोइन प्रथिने तयार होतात की नाही हे तपासण्यासाठी, स्वीडिश ब्रिज स्पायडर (लॅरीनिओइड्स स्कोपेटेरियस) च्या मोठ्या एम्पुला ग्रंथीमधून कोटिंग गोळा केले गेले.कोटिंग्ज 20 mM Tris-HCl बफरमध्ये 50 mg/mL (मापलेल्या कोरड्या वजनावर आधारित) साठवल्या गेल्या होत्या, परंतु 37 °C (पूरक आकृती 2a) वर 21 दिवसांच्या उष्मायनाच्या वेळी कोणतेही जेलेशन दिसून आले नाही.
या जेलचे प्रमाण निश्चित करण्यासाठी, जिलेशन प्रक्रियेचा अभ्यास करण्यासाठी आणि एकूण यांत्रिक गुणधर्म निर्धारित करण्यासाठी rheological मापांचा वापर केला जाऊ शकतो.विशेषतः, भारदस्त तापमानात स्टोरेज मॉड्यूलस (लवचिकता) चे निरीक्षण केल्याने जेलिंग तापमान तसेच कोटिंगच्या व्हिस्कोइलास्टिक गुणधर्मांबद्दल माहिती मिळू शकते.तापमान वाढीचे प्रयोग (नैसर्गिक सिल्क स्टॉक सोल्यूशन्सचा वापर करून मागील अभ्यासावर आधारित 1°C/min 25-45°C वर वापरणे) 40,41 ने दर्शविले की वाढत्या तापमानासह His-NT2RepCT आणि NT सोल्यूशन्सची स्टोरेज मोड्युली वाढली आहे.वाढले होते (चित्र 2 आणि पूरक आकृती 3).उल्लेखनीय म्हणजे, NT मॉड्यूल हिस-NT2RepCT च्या तुलनेत कमी तापमानात वाढू लागले, जेव्हा NT हिस-NT2RepCT सह 37°C (आकृती 1) वर थेट उष्मायन केले जाते तेव्हा जलद जेल वेळेशी सुसंगत होते.तापमानात नंतरच्या घसरणीनंतर, स्टोरेज मॉड्यूलस कमी मूल्यांकडे परत आले नाही आणि तोटा मॉड्यूलसच्या वर राहिले (पूरक चित्र 3 पहा), जे थर्मलली अपरिवर्तनीय स्थिर जेलेशन दर्शवते.जिलेशन केल्यानंतर, अंतिम लवचिक मापांक हिस-एनटी2आरपीसीटी हायड्रोजेलसाठी 15 ते 330 kPa पर्यंत 100-500 mg/mL च्या एकाग्रतेमध्ये आणि NT हायड्रोजेल्ससाठी (100-500 mg/mL) अंतिम लवचिक मापांक 00 ते 2 1414 पर्यंत होते. kPa (Fig. , 2 आणि संपूर्ण रॅम्प डेटा) पुरवणी चित्र 3 पहा).
हिस-NT2RepCT (300 mg/mL) आणि b NT (300 mg/mL) च्या थरथरणाऱ्या मापांच्या दरम्यान तापमानात बदल.बाण तापमानाचा ट्रेंड दर्शवतात आणि स्टोरेज मॉड्यूल डेटाची फिकट छायांकन निर्मात्याने निर्दिष्ट केलेल्या साधनापेक्षा कमी टॉर्क मूल्यांवर चाचणी दर्शवते, जे वाढत्या आवाजाचे कारण आहे.c उच्च तापमानानंतर (100, 300, आणि 500 ​​mg/mL) His-NT2RepCT आणि NT चे एंड-मॉड्यूल जमा करणे.सर्व मॉड्यूल रीडिंग 0.1 Hz च्या वारंवारतेने घेतले जातात.
जिलेशनशी संबंधित संरचनात्मक बदलांची तपासणी करण्याची संभाव्य पद्धत म्हणून, आम्ही 37°C (आकृती 3a,b) वर जिलेशन करण्यापूर्वी आणि नंतर His-NT2RepCT आणि NT चे FTIR स्पेक्ट्रा रेकॉर्ड केले.अपेक्षेप्रमाणे, His-NT2RepCT आणि NT सोल्यूशन्सचा स्पेक्ट्रा α-helix/यादृच्छिक कॉइल दुय्यम संरचना दर्शविणाऱ्या प्रथिनांशी सुसंगत आहे, 1645 cm-1 वर उच्चारित बँड आहे.दोन्ही हायड्रोजेलसाठी, जेलेशनमुळे मध्य I बँडमध्ये सुमारे 1617 cm-1 आणि 1695 cm-1 (Fig. 3a, b) दोन हातांची निर्मिती झाली, जे अँटी-पॅरलल β-शीट संरचनांची निर्मिती दर्शवते.हे बदल संबंधित द्वितीय व्युत्पन्न आणि फरक जिलेशन स्पेक्ट्रामध्ये देखील स्पष्टपणे पाहिले जाऊ शकतात (पूरक चित्र 4b).NT β-लेयरचे दोन बँड His-NT2RepCT पेक्षा अधिक स्पष्ट होते, जे दर्शविते की NT हायड्रोजेलमधील β-लेयर बँडची एकूण सामग्री NT2RepCT हायड्रोजेलपेक्षा जास्त आहे.
His-NT2RepCT आणि b NT चे FTIR शोषण स्पेक्ट्रा (दोन्ही 500 mg/mL) आधी (सोल्यूशन) आणि (जेल) उष्मायनानंतर 37°C वर.c 50 mg/ml NT2RepCT gels आणि d NT च्या रीस्पेंड केलेल्या TEM प्रतिमा.स्केल बार 200 एनएम.e His-NT2RepCT आणि NT हायड्रोजेलचे फायबर व्यास.n = 100 मोजलेले फायब्रिल्स, p < 0.0001.त्रुटी पट्ट्या मानक विचलन दर्शवतात.त्रुटी पट्ट्यांचे मध्यभागी मध्य आहे.सांख्यिकीय विश्लेषणासाठी एक अनपेअर टी-टेस्ट (दोन-पुच्छ) वापरली गेली.f विविध रीकॉम्बीनंट स्पायड्रोइन प्रथिने (100 mg/mL) 37 °C वर थरथरल्याशिवाय ThT फ्लूरोसेन्स.g NT (100 mg/mL) 0%, 5%, 10%, आणि 20% बियाांसह 100 mg/mL NT जेल पासून लसीकरण प्रयोग.
ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी (TEM) वापरून जेलच्या विश्लेषणात असे दिसून आले की हायड्रोजेलमध्ये अमायलोइड-सदृश फायब्रिल्स (Figs. 3c, 3d) असतात.NT-निर्मित फायब्रिल्स लांबलचक (5-12 nm व्यास) आणि शाखा नसलेले होते, तर His-NT2RepCT फायब्रिल्स लांबीने लहान आणि व्यासाने लक्षणीय रुंद (7-16 nm) (चित्र 3e) होते.या परिणामांमुळे आम्हाला थिओफ्लेविन टी (ThT) परख वापरून फायब्रोसिसच्या गतीशास्त्राचे अनुसरण करण्याची परवानगी मिळाली.सर्व रीकॉम्बिनंट स्पायड्रोइन प्रथिनांसाठी, जेव्हा नमुने 37 °C (Fig. 3f, पूरक Fig. 5a) वर उबवले गेले तेव्हा फ्लोरोसेंट सिग्नल वाढला.या निष्कर्षाशी सुसंगत, NT आणि His-NT2RepCT च्या सूक्ष्म तपासणीत जेलिंग परिस्थितीत ThT-पॉझिटिव्ह समुच्चय (पूरक चित्र 5b,c) लक्षात येण्याजोग्या स्थानिक संचयाविना ThT फ्लूरोसेन्समध्ये एकसमान वाढ दिसून आली.ThT-पॉझिटिव्ह फायब्रिल्सच्या निर्मितीमध्ये NT आणि His-NTCT टर्बिडिटी (पूरक चित्र 5d) मध्ये वाढ झाली नाही, याचा अर्थ जेलमधील फायब्रिल्सचे जाळे जेलच्या स्पष्टतेशी तडजोड न करता तयार होऊ शकते.थोड्या प्रमाणात पूर्व-निर्मित फायब्रिल्स जोडून बीजन केल्याने काही अमायलोइड्स ४२,४३,४४ च्या फायब्रिल निर्मितीला लक्षणीय गती मिळू शकते परंतु एनटी हायड्रोकोआगुलंट्सच्या द्रावणात ५%, १०% किंवा २०% (w/w) NT जोडली जाते.बीजन प्रभाव (Fig. 3g).कदाचित हे हायड्रोजेलमधील फायब्रिल्स तुलनेने स्थिर आहेत आणि बिया म्हणून वापरले जाऊ शकत नाहीत या वस्तुस्थितीमुळे आहे.
उच्च तापमानात रीकॉम्बीनंट स्पिड्रोइन प्रथिनांच्या अनपेक्षित वर्तनामुळे जेलच्या निर्मितीशी संबंधित संरचनात्मक बदल ओळखण्यासाठी पुढील परमाणु चुंबकीय अनुनाद (NMR) स्पेक्ट्रोस्कोपी अभ्यास करण्यास प्रवृत्त केले.37°C वर कालांतराने नोंदवलेल्या His-NT2RepCT सोल्यूशन्सच्या NMR स्पेक्ट्राने हे दाखवले की CT अजूनही अंशतः दुमडलेले होते, तर NT आणि 2Rep सिग्नल गायब झाले होते (चित्र 4a), हे सूचित करते की हे मुख्यतः NT आणि 2Rep होते जे अंशतः नियंत्रित होते. NT2RepCT हायड्रोजेल.CT सिग्नल देखील त्याच्या मूळ तीव्रतेच्या 20% पर्यंत कमी करण्यात आला होता, हे सूचित करते की CT देखील मुख्यतः स्थिर आहे आणि हायड्रोजेल संरचनेत समाविष्ट आहे.सीटीच्या लहान भागासाठी, जो प्री-इनक्यूबेटेड नमुन्याप्रमाणे मोबाईल आहे आणि अशा प्रकारे एनएमआर सोल्यूशनद्वारे निरीक्षण केले आहे, स्पेक्ट्रामध्ये पहिल्या 10 संरचित अवशेषांसाठी सिग्नलचा अभाव आहे, शक्यतो His-NT2Rep च्या संलग्न भागाच्या कठीण स्थिरीकरणामुळे.हायड्रोजेल्स -NT2RepCT च्या -स्टेटच्या NMR स्पेक्ट्राने α-हेलिसेस आणि β-स्तरांची प्रमुख उपस्थिती आणि काही प्रमाणात, यादृच्छिक कॉइल कॉन्फॉर्मेशन (चित्र 4b) प्रकट केले.केवळ NT मध्ये उपस्थित असलेल्या मेथिओनाइन अवशेषांच्या रासायनिक शिफ्ट विश्लेषणाने असे दिसून आले की हे डोमेन β-शीट संरचनेत रूपांतरित झाले आहे.सोल्युशनमधील एनटीच्या वेळ-आश्रित स्पेक्ट्राने सिग्नल तीव्रतेमध्ये एकसमान घट दर्शविली (चित्र 4c), आणि एनटी हायड्रोजेलच्या घन-स्थिती एनएमआरने दर्शविले की बहुतेक एनटी अवशेष β-शीट संरचनांमध्ये रूपांतरित झाले (चित्र 4d).2Rep ची रचना त्याच्या एकत्रित करण्याच्या प्रवृत्तीमुळे स्वतंत्रपणे निर्धारित केली जाऊ शकत नाही.तथापि, NTCT आणि His-NT2RepCT हायड्रोजेलचा घन अवस्थेतील NMR स्पेक्ट्रा खूपच सारखा दिसत होता (Fig. 4b; पूरक Fig. 6b), हे सूचित करते की 2Rep ने His-NT2RepCT हायड्रोजेलच्या संरचनात्मक भागामध्ये थोडे योगदान दिले.सीटी हायड्रोजेल्ससाठी, α-हेलीसेस, β-शीट्स आणि यादृच्छिक हेलिकल दुय्यम संरचना अस्तित्वात असल्याचे आढळले (पूरक चित्र 6d).हे सूचित करते की CT चे काही भाग α-helices राहतात तर काही β-sheets बनतात.अशाप्रकारे, एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपीचे परिणाम असे सूचित करतात की एनटी हायड्रोजेल निर्मितीसाठी महत्त्वपूर्ण आहे आणि 2Rep आणि CT सह संलयन केल्यावर β-शीट कॉन्फॉर्मेशनमध्ये देखील रूपांतरित होते.याच्याशी सुसंगत, आम्हाला अलीकडे असे आढळले आहे की एनटी डोमेनच्या पाचही हेलिकेसमध्ये अमायलोइड स्पेशियल झिपर्स तयार होण्याची शक्यता आहे आणि वॉल्ट्झ अल्गोरिदमने हेलिक्स 1 (चित्र 4e) मध्ये अमायलोइडोजेनिक क्षेत्राचा अंदाज लावला आहे.
15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT द्रावणाचा 2D स्पेक्ट्रा (निळा) आणि 19 तास उष्मायनानंतर (लाल) 37°C वर.लाल स्पेक्ट्रममधील वैयक्तिक क्रॉस शिखरे आणि निळ्या स्पेक्ट्रममधील F24, G136, polyA हे एकल अक्षर अमिनो आम्ल चिन्हे आणि अवशेष संख्यांनी दर्शविले जातात.NT, 2Rep आणि CT डोमेनमधील निवडलेल्या अवशेषांसाठी इनसेट वेळेवर सिग्नल तीव्रतेचे अवलंबित्व दर्शवतात.b His-NT2RepCT हायड्रोजेलचा सॉलिड-स्टेट रेडिओफ्रिक्वेंसी (RFDR) स्पेक्ट्रा.RFDR स्पेक्ट्रामध्ये आढळलेल्या Cα/Cβ अवशेषांचे सहसंबंध मॉडेल पेप्टाइड रासायनिक शिफ्ट आणि आकडेवारी 82,83 आणि त्यांच्या दुय्यम संरचनांमधून मिळालेल्या मूल्यांशी तुलना करून निर्धारित केले गेले.SSB - फिरणारा साइडबँड.c 15N-HSQC 10 mg/mL NT द्रावणाचा एक-आयामी स्पेक्ट्रा 36 तासांसाठी 37 °C वर उष्मायन दरम्यान.इनसेट वेळ विरुद्ध व्हॉल्यूमेट्रिक तीव्रता दर्शविते.d NT हायड्रोजेलचे सॉलिड स्टेट RFDR स्पेक्ट्रा.RFDR स्पेक्ट्रामध्ये Cα/Cβ अवशेष आणि त्यांच्या दुय्यम संरचनांचे सहसंबंध सूचित केले आहेत.e Zipper डेटाबेस (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) मधील NT45.79 फायब्रिलेशन प्रोपेन्सिटी प्रोफाइलवर आधारित.हेक्सापेप्टाइडच्या अवकाशीय विजेच्या शिफ्ट विंडोची रोसेटा ऊर्जा kcal/mol मध्ये दर्शविली आहे.लाल पट्ट्या उच्च फायब्रोसिस प्रवृत्तीसह हेक्सापेप्टाइड्स दर्शवितात (रोसेटा ऊर्जा -23 kcal/mol खाली; ठिपकेदार रेषेच्या खाली).हिरव्या पट्ट्या थ्रेशोल्डच्या वर असलेल्या रोझेटा एनर्जी असलेले तुकडे दर्शवतात आणि त्यामुळे स्टेरिक झिपर्स तयार होण्याची शक्यता कमी असते.प्रोलिन असलेले तुकडे विश्लेषणातून वगळले गेले (स्तंभांशिवाय).वॉल्ट्ज अल्गोरिदम81 (https://waltz.switchlab.org) द्वारे भाकीत केलेले स्क्वेअर अमायलोइडोसिसचे क्षेत्र दर्शवतात.NT च्या अमिनो आम्ल अवशेषांचा क्रम सर्वात वर आहे, आणि β दुय्यम संरचनेत (सॉलिड-स्टेट NMR स्पेक्ट्रोस्कोपीद्वारे निर्धारित केलेले) अवशेषांचे प्रकार लाल रंगात दर्शविले आहेत.पाच NT α-हेलीसेसची स्थिती (H1-H5)28 म्हणून नियुक्त केली आहे.
pH <6.5 वर, HT उष्णतेला प्रतिरोधक असल्याने- किंवा युरिया-प्रेरित विकृतीकरण18 कमी होते.एनटी डायमेरायझेशन आणि स्थिरता जिलेशनवर कसा परिणाम करते हे स्पष्ट करण्यासाठी, 100 mg/ml NT असलेले द्रावण pH 8, 7, आणि 6 वर नियंत्रित केले गेले.NT नमुने pH 8 आणि 7 वर 30 मिनिटांनंतर 37 °C वर उष्मायन केले, परंतु pH 8 जेल स्पष्ट राहिले, तर pH 7 जेलने दृश्यमान अवक्षेपण (Fig. 5a) दाखवले.याउलट, pH 6 वर HT असलेले द्रावण जेल तयार करत नाही आणि 20 मिनिटांनंतर 37°C वर एक मोठा अवक्षेपण दिसू शकतो.हे सूचित करते की डायमर स्वतः आणि/किंवा मोनोमर्सच्या तुलनेत त्यांची उच्च स्थिरता जिलेशन प्रतिबंधित करते.पीएच 7 आणि 6 वर NT साठी अवक्षेपण तयार होणे अपेक्षित नव्हते, कारण असे नोंदवले गेले आहे की NT 200 mg/ml27 वर विरघळते, उष्णता विकृत झाल्यानंतर सहजपणे पुन्हा फोल्ड होते आणि कमी मूल्यांवर α-हेलिक्स देखील राखून ठेवते. pH 18. या विसंगतींचे संभाव्य स्पष्टीकरण असे आहे की पूर्वी नोंदवलेले प्रयोग खोलीच्या तपमानावर किंवा त्यापेक्षा कमी, किंवा तुलनेने कमी प्रथिने सांद्रता 16,18,19 वर केले गेले.
37°C वर उष्मायनानंतर पीएच 8, 7, 6 आणि 154 mM NaCl (pH 8) वर NT कुपी इन्व्हर्शन चाचणी (100 mg/mL).b NT CD स्पेक्ट्रा अनुक्रमे 154 mM NaF आणि 154 mM NaCl सह आणि त्याशिवाय.222 nm वर मोलर लंबवर्तुळ नैसर्गिक पटांच्या प्रमाणात रूपांतरित होते.c NT उलटा परख (100 mg/mL) NT* (37 °C आणि 60 °C), NTA72R (37 °C), आणि His-NT-L6 (37 °C आणि 60 °C).d NT म्युटंट्स NT*, NTA72R, आणि His-NT-L6 चे CD स्पेक्ट्रा.222 nm वर मोलर लंबवर्तुळ नैसर्गिक पटांच्या प्रमाणात रूपांतरित होते.ई NTFlSp, NTMiSp आणि कमी NTMiSp (100 mg/mL) ची उलट चाचणी.स्केल बार 5 मिमी.f NT चे CD स्पेक्ट्रा, NTFlSp, NTMiSp आणि कमी केलेले NTMiSp.222 nm वर मोलर लंबवर्तुळ नैसर्गिक पटांच्या प्रमाणात रूपांतरित होते.25 °C आणि 95 °C वर पूर्ण NT स्पेक्ट्रा पूरक आकृती 8 मध्ये दर्शविला आहे.
शारीरिक मीठ एकाग्रता NT सबयुनिट्समधील इलेक्ट्रोस्टॅटिक परस्परसंवाद आणि कमी pH18 वर NT हस्तांतरणाचे dimerization निर्धारित करते.आम्हाला आढळले की 154 mM NaCl आणि NaF च्या उपस्थितीने अनुक्रमे जिलेशन रोखले (Fig. 5a, b; पूरक Fig. 2b) आणि या क्षारांनी NT मोनोमर्सची थर्मल स्थिरता वाढवली (Fig. 5b, पूरक Fig. 8) .हे देखील सूचित करते की स्थिरता वर्धित करणे, डायमरायझेशन ऐवजी, जेल निर्मिती प्रतिबंधित करते.
प्रथिने डायमरायझेशन आणि जेलेशनमध्ये स्थिरतेची भूमिका जाणून घेण्यासाठी, आम्ही NT* आणि NTA72R या दोन उत्परिवर्तनांचा वापर केला, जे कमी pH28.30 वर देखील मोनोमेरिक राहतात.NT* हे दुहेरी चार्ज रिव्हर्सल म्युटंट आहे ज्यामध्ये मोनोमरचे स्पष्ट द्विध्रुवीय चार्ज वितरण सपाट केले जाते, जे डायमरायझेशन प्रतिबंधित करते आणि मोनोमर स्थिरता तीव्रपणे वाढवते.NTA72R हा चार्ज केलेला द्विध्रुव आहे, परंतु Arg-substituted Ala डायमर सीमेवर स्थित आहे, म्हणून उत्परिवर्तन डायमरायझेशनसाठी आवश्यक सबयुनिट परस्परसंवादांमध्ये व्यत्यय आणतात.37°C वर उष्मायन केल्यावर, NT* ने हायड्रोजेल तयार केले नाही, तर NTA72R ने 15 मिनिटांसाठी अपारदर्शक जेल तयार केले (चित्र 5c).NT* आणि NTA72R दोन्ही डायमराइज करू शकत नाहीत परंतु मोनोमर स्थिरता (चित्र 5d) मध्ये भिन्न असल्याने, हे परिणाम जोरदारपणे सूचित करतात की उच्च थर्मोडायनामिक स्थिरता NT ला जळण्यापासून प्रतिबंधित करते.HT* उच्च तापमानात (8 मिनिटांनंतर 60°C वर; Fig. 5c) अस्थिर असताना एक जेल बनवते या वस्तुस्थितीद्वारे देखील हे समर्थित आहे.पूर्वी असे दिसून आले आहे की NT मधील मेथिओनाइनची उच्च सामग्री त्याच्या नैसर्गिक फोल्डिंगला द्रव बनवते आणि सहा मेट टू लियू पर्याय (येथे हिस-एनटी-एल6 म्हणून संदर्भित) NT46 मोनोमर मजबूतपणे स्थिर करतात.NT जेल निर्मितीसाठी संरचनात्मक लवचिकता आवश्यक आहे या गृहितकावर आधारित, आम्हाला आढळले की His-NT-L6 स्थिर उत्परिवर्ती 37 °C (आकृती 5c, d) वर जेल करत नाही.तथापि, His-NT-L6 ने 60 °С वर 60 मिनिटांसाठी (Fig. 5c) उष्मायन केल्यावर एक जेल देखील तयार केले.
β-शीट स्ट्रक्चर्समध्ये रूपांतरित होण्याची आणि हायड्रोजेल तयार करण्याची NT ची क्षमता स्पिड्रोइनच्या काही परंतु सर्व NT डोमेनवर लागू होते असे दिसते.विविध रेशीम प्रकार आणि स्पायडर प्रजाती, ट्रायकोनेफिला क्लेव्हीप्स (NTFlSp) मधील एनटी, तुलनेने कमी मेथिओनाइन सामग्री आणि उच्च थर्मल स्थिरता (चित्र 5e, f आणि पूरक तक्ता 2) असूनही जेल तयार करतात.याउलट, कमी थर्मल स्थिरता आणि उच्च मेथिओनाइन सामग्रीसह एरेनियस व्हेंट्रिकोसस (NTMiSp) मधील लहान एम्प्युलर प्रोटीन स्पिड्रोइनमधील एनटी हायड्रोजेल तयार करत नाही (पूरक तक्ता 2 आणि अंजीर 5e, f).नंतरचे इंट्रामोलेक्युलर डायसल्फाइड बाँड्स 29,47 च्या उपस्थितीशी संबंधित असू शकते.सातत्याने, जेव्हा NTMiSp चे डायसल्फाइड बंध कमी केले गेले, तेव्हा ते 10 मिनिटे (चित्र 5e) 37°C वर उष्मायनानंतर हायड्रोजेल तयार झाले.शेवटी, हे लक्षात घेतले पाहिजे की एनटीपासून जेलच्या निर्मितीसाठी संरचनात्मक लवचिकता हा एक महत्त्वाचा, परंतु एकमेव निकष नाही.आणखी एक घटक जो संबंधित असू शकतो तो म्हणजे अमायलोइड फायब्रिल्स तयार करण्याची प्रवृत्ती आणि झिपर डेटाबेस आणि वॉल्ट्झ अल्गोरिदमच्या विश्लेषणाने जेल तयार करण्याची क्षमता आणि अमायलोइडोजेनिक प्रदेशांची उपस्थिती, तसेच अंदाज केलेल्या प्रदेशांची व्याप्ती यांच्यातील परस्परसंबंध दिसून आला. स्टेरिक झिपर्स तयार करण्यासाठी.एक सहसंबंध होता (पूरक तक्ता 2 आणि पूरक अंजीर. 9).
अनुकूल परिस्थितीत फायब्रिल्स आणि जेल तयार करण्याच्या एनटीच्या क्षमतेमुळे आम्हाला असे गृहित धरले गेले की इतर प्रथिनांच्या तुकड्यांसह एनटी फ्यूजन अद्याप फ्यूजन भागीदारांच्या पूर्ण कार्यासह जेल तयार करू शकतात.याची चाचणी करण्यासाठी, आम्ही NT च्या C-टर्मिनस येथे अनुक्रमे ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) आणि प्युरिन न्यूक्लिओसाइड फॉस्फोरिलेस (PNP) सादर केले.परिणामी संलयन प्रथिने E. coli मध्ये अत्यंत उच्च अंतिम उत्पन्नासह (हिस-NT-GFP आणि His-NT-PNP साठी अनुक्रमे 150 mg/L आणि 256 mg/L शेक फ्लास्क कल्चर) दर्शविल्या गेलेल्या दाखवल्या गेलेल्या गोष्टींशी सुसंगत होती. एनटी रेफमध्ये मिसळलेल्या इतर प्रथिनांसाठी.30. His-NT-GFP (300mg/mL) आणि His-NT-PNP (100mg/mL) फ्यूजन प्रथिने 2 तास आणि 6.5 तासांनंतर 37°C तापमानावर जेल तयार करतात आणि महत्त्वाचे म्हणजे GFP अंश अपरिवर्तित राहिले.जिलेशन नंतर निरीक्षण केले जाते, जिलेशन नंतर प्रारंभिक फ्लोरोसेन्स तीव्रतेच्या >70% शिल्लक राहते (चित्र 6a).त्याच्या-NT-PNP सोल्यूशन्स आणि जेलमध्ये PNP क्रियाकलाप मोजण्यासाठी, आम्हाला NT सह फ्यूजन प्रोटीन पातळ करावे लागले कारण शुद्ध तयारीची एन्झाईमॅटिक क्रिया gelling सांद्रतामध्ये परखच्या शोध श्रेणीच्या बाहेर होती.0.01 mg/mL His-NT-PNP आणि 100 mg/mL NT असलेल्या मिश्रणाने तयार झालेल्या जेलने प्री-इनक्यूबेटेड नमुन्यांची सुरुवातीच्या एन्झाईमॅटिक क्रिया 65% राखून ठेवली (चित्र 6b).मापन दरम्यान जेल अखंड राहिले (पूरक अंजीर. 10).
His-NT-GFP (300 mg/mL) आणि दृश्यमान आणि अतिनील प्रकाशाखाली His-NT-GFP हायड्रोजेल (300 mg/mL) असलेली उलटी कुपी जमा होण्यापूर्वी आणि नंतर सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता.पॉइंट्स वैयक्तिक मोजमाप दर्शवतात (n = 3), त्रुटी पट्ट्या मानक विचलन दर्शवतात.सरासरी मूल्य त्रुटी पट्ट्यांच्या मध्यभागी दर्शविले आहे.b PNP क्रियाकलाप NT (100 mg/ml) आणि 0.01 mg/ml his-NT-PNP आणि 100 mg/ml नवीन तैवान डॉलर्स असलेले मिश्रण आणि द्रावण आणि जेल वापरून फ्लोरोमेट्रिक विश्लेषणाद्वारे प्राप्त केले गेले.इनसेट हिस-NT-PNP (5 मिमी स्केल बार) असलेले हायड्रोजेल असलेली उलटी कुपी दाखवते.
येथे, आम्ही 37°C (आकृती 1) वर प्रथिने द्रावण उष्मायन करून NT आणि इतर रीकॉम्बिनंट स्पिड्रॉइन प्रथिनांपासून हायड्रोजेल तयार झाल्याचा अहवाल देतो.आम्‍ही दाखवतो की जिलेशन हे α-helices चे β-layers मध्ये परिवर्तन आणि amyloid-like fibrils (Figs. 3 आणि 4) च्या निर्मितीशी संबंधित आहे.हा शोध आश्चर्यकारक आहे कारण NTs गुंडाळलेले ग्लोब्युलर पाच-हेलिक्स बंडल आहेत जे त्यांच्या अत्यंत उच्च विद्राव्यता आणि उच्च स्थिरतेसाठी 200 mg/mL वर 4°C वर अनेक दिवसांसाठी ओळखले जातात27.याव्यतिरिक्त, μM मध्ये कमी प्रथिने एकाग्रतेवर उष्मा विकृतीनंतर NTs सहजपणे पुन्हा फोल्ड होतात.आमच्या परिणामांनुसार, फायब्रिल निर्मितीसाठी >10 mg/mL प्रोटीन एकाग्रता आणि किंचित उन्नत तापमान (Fig. 1) यांचे मिश्रण आवश्यक आहे.हे या कल्पनेशी सुसंगत आहे की अ‍ॅमिलॉइड फायब्रिल्स ग्लोब्युलरली फोल्ड केलेल्या प्रथिनांपासून तयार होऊ शकतात जे शारीरिक स्थितीत थर्मल चढउतारांमुळे अंशतः उलगडलेल्या स्थितीत असतात 48.हे रूपांतरण घडवून आणणाऱ्या प्रथिनांच्या उदाहरणांमध्ये इंसुलिन 49,50, β2-मायक्रोग्लोबुलिन, ट्रान्सथायरेटिन आणि लाइसोझाइम 51,52,53 यांचा समावेश होतो.जरी NT त्याच्या मूळ स्थितीत α-हेलिक्स असले तरी, अंदाजे 65% पॉलीपेप्टाइड साखळी स्टेरिक झिपर फॉर्मेशन (Fig. 4e) 45 शी सुसंगत आहे.मोनोमर गतिमानपणे मोबाईल46 असल्याने, ते या संभाव्य अमायलोइडोजेनिक क्षेत्रांना माफक प्रमाणात भारदस्त तापमानात उघड करू शकते आणि एकूण प्रथिनांच्या उच्च एकाग्रतेवर अमायलोइड फायब्रिल निर्मितीसाठी गंभीर एकाग्रतेपर्यंत पोहोचू शकते54.या तर्कानंतर, आम्हाला स्पायड्रोइन एकाग्रता आणि जेलेशन वेळ (Fig. 1c) यांच्यात नकारात्मक संबंध आढळला आणि जर मोनोमेरिक एनटी कॉन्फॉर्मेशन एकतर उत्परिवर्तन (NT*, His-NT-L6) किंवा मीठ जोडण्याद्वारे स्थिर केले गेले, तर ते रोखू शकते. निर्मिती hydrogels (Fig. 5).
बहुतेक प्रकरणांमध्ये, अमायलोइड फायब्रिल्स द्रावणातून अवक्षेपण म्हणून अदृश्य होतात, परंतु काही विशिष्ट परिस्थितीत ते हायड्रोजेल्स 55,56,57 तयार करू शकतात.हायड्रोजेल-फॉर्मिंग फायब्रिल्समध्ये सामान्यत: उच्च गुणोत्तर असते आणि ते आण्विक गुंताद्वारे स्थिर त्रि-आयामी नेटवर्क तयार करतात, 55,58 आमच्या परिणामांशी सुसंगत.विट्रोमध्ये हायड्रोजेल निर्मितीसाठी, प्रथिने बहुतेकदा पूर्णपणे किंवा अंशतः उलगडली जातात, उदाहरणार्थ, सेंद्रिय सॉल्व्हेंट्सच्या संपर्कात आल्याने, उच्च तापमान (70-90°C) आणि/किंवा कमी pH (1.5–3.0)59,60,61,62.येथे वर्णन केलेल्या स्पायड्रोइन हायड्रोजेलना कठोर प्रक्रियेची आवश्यकता नाही किंवा त्यांना हायड्रोजेल स्थिर करण्यासाठी क्रॉस-लिंकिंग एजंट्सची आवश्यकता नाही.
यापूर्वी असे नोंदवले गेले आहे की स्पिड्रॉइनची पुनरावृत्ती होते आणि क्यूडी, जे रेशीम कताई दरम्यान β-शीट स्विचिंगमधून जातात, ते हायड्रोजेल तयार करतात.आमच्या निष्कर्षांच्या तुलनेत, उष्मायन वेळा आणि/किंवा उष्मायन तापमान अनुक्रमे लक्षणीयरीत्या जास्त किंवा जास्त होते, आणि परिणामी हायड्रोजेल अनेकदा अपारदर्शक होते (आकृती 7 आणि पूरक तक्ता 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. जलद जेल वेळा व्यतिरिक्त, NT हायड्रोजेल >300 mg/mL (30%) इतर सर्व वर्णन केलेल्या रीकॉम्बीनंट स्पायडर सिल्क प्रोटीन हायड्रोजेल, तसेच नैसर्गिक हायड्रोजेल जसे की जिलेटिन, अल्जिनेट (2%), आगर (0.5%) पेक्षा जास्त कामगिरी केली. ) आणि कोलेजन.(0.6%) (आकृती 7 आणि पूरक तक्ते 1 आणि 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
या अभ्यासातील हायड्रोजेलचा जेल वेळ आणि लवचिक मॉड्यूलसची तुलना इतर स्पायड्रोइन-आधारित हायड्रोजेल आणि निवडलेल्या नैसर्गिक हायड्रोजेलशी केली गेली.जिलेशन परिस्थितीच्या वर्णनासह संदर्भ दिले आहेत.एपीएस अमोनियम पर्सल्फेट, खोलीचे तापमान.डेटा ३७, ३८, ३९, ६४, ६५, ६६, ६७, ६८, ६९, ७०, ७१, ७२, ७३, ७४.
स्पायड्रोइन स्टोरेज दरम्यान जेलिंग होण्यापासून रोखण्यासाठी स्पायडरने मार्ग विकसित केलेले दिसतात.रेशीम ग्रंथीमध्ये प्रथिनांची उच्च एकाग्रता असूनही, टर्मिनल डोमेनशी संबंधित मोठ्या पुनरावृत्ती क्षेत्राचा अर्थ असा आहे की या अभ्यासाच्या सीमेवर, ग्रंथीमध्ये NT आणि CT ची स्पष्ट एकाग्रता अंदाजे 10-20 mg/ml शी संबंधित आहे.इन विट्रो निरीक्षण केलेल्या हायड्रोजेल निर्मितीसाठी आवश्यक.याव्यतिरिक्त, रेशीम ग्रंथी (Fig. 5b) प्रमाणे, 16 स्थिर NT च्या समान सांद्रता.E. coli cytosol मध्ये NT conformation चा अभ्यास केला गेला आहे आणि व्हिट्रोमध्ये तपासले असता ते अधिक घट्ट दुमडलेले आढळले आहे, पुढे असे सूचित करते की मीठ किंवा इतर घटक व्हिव्होमध्ये त्याचे एकत्रीकरण रोखतात.तथापि, β-शीट फायब्रिल्समध्ये रूपांतरित होण्याची एनटीची क्षमता फिलामेंट निर्मितीसाठी महत्त्वाची असू शकते आणि भविष्यातील अभ्यासांमध्ये त्याची तपासणी केली पाहिजे.
या अभ्यासात आढळलेल्या NT-amyloid-सारख्या फायब्रिल आणि हायड्रोजेल निर्मितीच्या नवीन पैलूंव्यतिरिक्त, आम्ही हे देखील दर्शवितो की या घटनेत जैवतंत्रज्ञान आणि जैववैद्यकीय अनुप्रयोग असू शकतात (चित्र 8).संकल्पनेचा पुरावा म्हणून, आम्ही NT ला GFP किंवा PNP सह एकत्र केले आणि हे दाखवून दिले की फ्यूजन प्रोटीन देखील 37 °C वर उष्मायन केल्यावर हायड्रोजेल बनवते आणि GFP आणि PNP अपूर्णांक मोठ्या प्रमाणात गेलेशन नंतर त्यांची क्रिया टिकवून ठेवतात (आकृती 6).न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरायलेसेस हे न्यूक्लियोसाइड अॅनालॉग्स75 चे महत्त्वपूर्ण उत्प्रेरक संश्लेषण आहेत, ज्यामुळे आमचा शोध बायोफार्मास्युटिकल उद्योगासाठी उपयुक्त ठरतो.अनुकूल परिस्थितीत पारदर्शक हायड्रोजेल तयार करणारे फ्यूजन प्रथिने व्यक्त करण्याची संकल्पना एंजाइम स्थिरीकरण, नियंत्रित औषध सोडणे आणि ऊतक अभियांत्रिकी यासारख्या विस्तृत अनुप्रयोगांसाठी अनुकूल गुणधर्मांसह कार्यात्मक हायड्रोजेल तयार करण्यास अनुमती देते.याव्यतिरिक्त, NT आणि NT* हे कार्यक्षम अभिव्यक्ती मार्कर 30 आहेत, ज्याचा अर्थ NT आणि त्याची रूपे विरघळणारे फ्यूजन प्रथिनांच्या उच्च-थ्रूपुट उत्पादनासाठी आणि 3D हायड्रोजेलमध्ये स्थिर लक्ष्य प्रथिने तयार करण्यासाठी वापरली जाऊ शकतात.
NT विरघळणारे, α-पेचदार आणि कमी सांद्रता (µM) आणि 37°C वर स्थिर आहे.त्याच तपमानावर, परंतु वाढत्या एकाग्रतेवर (>10 mg/ml), NT अ‍ॅमिलॉइड सारखी फायब्रिल्स असलेली जेल बनवते.NT फ्यूजन प्रथिने पूर्णपणे कार्यशील फ्यूजन तुकड्यांसह फायब्रिलर जेल देखील तयार करतात, ज्यामुळे विविध प्रथिने NT चा वापर करून 3D हायड्रोजेलमध्ये स्थिर होऊ शकतात.तळ: NT (PDB: 4FBS) आणि फायबर नेटवर्क आणि संबंधित प्रथिने संरचनांचे चित्र (गृहीत धरलेले आणि स्केलवर काढलेले नाही, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.22210/pdbRdJ).
रचना (अमीनो ऍसिड अनुक्रमांसह संपूर्ण यादीसाठी पूरक तक्ता 4 पहा) प्लाझमिड pT7 मध्ये क्लोन केले गेले आणि E. coli BL21 (DE3) मध्ये रूपांतरित झाले.इंजिनीयर्ड प्लाझमिड्स असलेले ई. कोलाई लुरिया मटनाचा रस्सा कॅनामायसिन (70 mg/l) सह पूरक आणि 30°C आणि 250 rpm वर रात्रभर वाढवले ​​गेले.नंतर कल्चर 1/100 एलबी माध्यमात टोचले गेले ज्यामध्ये कॅनामायसिन आहे आणि OD600 0.8 पर्यंत पोहोचेपर्यंत 30°C आणि 110 rpm वर कल्चर केले गेले.एनएमआर अभ्यासासाठी, समस्थानिकांसह प्रथिने लेबलिंगसाठी 2 ग्रॅम डी-ग्लूकोज 13C (अल्ड्रिच) आणि 1 ग्रॅम अमोनियम क्लोराईड 15N (केंब्रिज आइसोटोप लॅबोरेटरीज, इंक.) असलेल्या M9 किमान माध्यमात जीवाणू वाढले होते.तापमान 20 अंश सेल्सिअस पर्यंत कमी करा आणि 0.15 मिमी आयसोप्रोपाइलथिओगॅलॅक्टोपिरानोसाइड (अंतिम एकाग्रता) सह प्रथिने अभिव्यक्ती प्रेरित करा.रात्रभर प्रथिने अभिव्यक्तीनंतर, 20 मिनिटांसाठी 7278×g, 4°C वर पेशींची कापणी केली गेली.सेल पेलेट्स 20 मिमी ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8 मध्ये पुन्हा निलंबित केले गेले आणि पुढील वापर होईपर्यंत गोठवले गेले.30 kPa वर वितळलेल्या पेशी सेल डिसप्टर (TS सीरीज मशीन्स, कॉन्स्टंट सिस्टम्स लिमिटेड, इंग्लंड) वापरून लायझ केल्या गेल्या.नंतर 4 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 30 मिनिटांसाठी 25,000 ग्रॅमवर ​​लायसेट्स सेंट्रीफ्यूज केले गेले.NTMiSp साठी, गोळी नंतर 2 M युरिया, 20 mM Tris-HCl, pH 8 मध्ये पुन्हा सस्पेंड केली गेली आणि 2 मिनिटे (2 s चालू/बंद, 65%) साठी सोनिकेटेड केली गेली, नंतर पुन्हा 25,000 xg, 4° C च्या आत सेंट्रीफ्यूज केली गेली. ३० मि.सुपरनेटंटला Ni-NTA स्तंभावर लोड केले गेले, 20 mM Tris-HCl, 2 mM इमिडाझोल, pH 8 ने धुतले गेले आणि शेवटी प्रथिने 20 mM Tris-HCl, 200 mM इमिडाझोल, pH 8 सह धुतले गेले. NT2RepCT आणि तयार करण्यासाठी NTCT, थ्रॉम्बिन पचन त्याच्या आणि NT दरम्यान साइट (ThrCleav) ओळखते.हिस-एनटी-थ्रक्लीव्ह-2रेप (2आरपीचे उत्पादन करते), हिज-थिओरेडॉक्सिन-थ्रक्लीव्ह-एनटी (एनटी तयार करते), हिज-थिओरेडॉक्सिन-थ्रक्लीव्ह-सीटी (सीटी तयार करते), हिज-थिओरेडॉक्सिन-थ्रक्लीव्ह-एनटीमध्ये थ्रोम्बिन क्लीव्हेज साइट्स देखील आहेत. .* (NT* चे उत्पादन करते), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R चे उत्पादन करते), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp चे उत्पादन करते), आणि His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (एनटीएमआयएसपी तयार करते).थ्रॉम्बिन (1:1000) सह रचना पचवल्या गेल्या आणि 6-8 kDa च्या आण्विक वजन थ्रेशोल्डसह स्पेक्ट्रा/पोर डायलिसिस झिल्ली वापरून 20 मिमी ट्रिस-एचसीएल, pH 8 सह 4° C वर रात्रभर डायलायझ केले गेले.डायलिसिसनंतर, द्रावण Ni-NTA स्तंभावर लोड केले जाते आणि स्वारस्य असलेले प्रथिने असलेले सांडपाणी गोळा केले जाते.निर्मात्याच्या प्रोटोकॉलनुसार ब्रॅडफोर्ड परख वापरणार्‍या NTF1Sp व्यतिरिक्त, प्रत्येक प्रथिनेचा विलोपन गुणांक वापरून 280 nm वर UV शोषकता मोजून प्रथिने सांद्रता निर्धारित केली गेली.शुद्धता SDS पॉलीएक्रिलामाइड (4-20%) जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस आणि कूमासी ब्रिलियंट ब्लू स्टेनिंगद्वारे निर्धारित केली गेली.20 मिनिटांच्या सायकलमध्ये 10 kDa आण्विक वजन कटऑफसह 4000 xg वर सेंट्रीफ्यूज फिल्टर (VivaSpin 20, GE Healthcare) वापरून प्रथिने केंद्रित केली गेली.
प्रथिने द्रावण वितळवून 150 µl काळजीपूर्वक 1 मिली क्लिअर सेप्टम वायल (8 x 40 मिमी थर्मो सायंटिफिक) मध्ये टाका.बाष्पीभवन टाळण्यासाठी नळ्या पॅराफिल्मने बंद करून बंद केल्या होत्या.नमुने (n = 3) 37°C किंवा 60°C तपमानावर उष्मायन केले गेले आणि कालांतराने जिलेशनचे निरीक्षण करण्यासाठी उलटे केले गेले.जे नमुने जेल केले नाहीत त्यांना किमान एक आठवडा उष्मायन केले गेले.NTMiSp डायसल्फाइड बंध 10 mM DTT प्रति 10 µM प्रोटीनसह कमी करा.नैसर्गिक स्पायडर सिल्क कोटिंग्जच्या जेलेशनचे विश्लेषण करण्यासाठी, स्वीडिश ब्रिज स्पायडर कापला गेला, दोन मुख्य अॅम्प्युलेटेड ग्रंथी 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल बफर पीएच 8 च्या 200 μl मध्ये ठेवल्या गेल्या आणि कोटिंगला ग्रंथीपासून वेगळे होण्यासाठी कापले गेले..ग्रंथींची सामग्री बफरमध्ये विरघळली जाते, कोरडे वजन निश्चित करण्यासाठी 50 μl (60 °C ते स्थिर वजनावर खुल्या कुपीच्या उष्मायनाद्वारे) आणि 37 °C तापमानावर जेलेशनसाठी 150 μl.
मापन भूमिती/साधन 20 मिमीच्या वरच्या व्यासासह आणि 0.5 मिमीच्या अंतरासह समांतर प्लेट वापरून स्टेनलेस स्टीलचे बनलेले आहे.25 °C ते 45 °C पर्यंत नमुना गरम करा आणि 25 °C पर्यंत 1 °C प्रति मिनिट दराने स्टेनलेस स्टीलच्या तळाशी पेल्टियर प्लेट वापरून परत करा.कंपन मोजमाप 0.1 Hz च्या वारंवारतेवर आणि सामग्रीच्या रेखीय व्हिस्कोइलास्टिक प्रदेशात अनुक्रमे 100 mg/mL आणि 300-500 mg/mL च्या नमुन्यांसाठी 5% आणि 0.5% च्या स्ट्रेनवर केले गेले.बाष्पीभवन टाळण्यासाठी सानुकूल आर्द्रता कक्ष वापरा.प्रिझम 9 वापरून डेटाचे विश्लेषण केले गेले.
800 ते 3900 सेमी-1 खोलीच्या तपमानावर इन्फ्रारेड (IR) स्पेक्ट्रा गोळा करण्यासाठी.एटीआर उपकरण, तसेच स्पेक्ट्रोमीटरद्वारे प्रकाशाचा मार्ग, प्रयोगापूर्वी आणि दरम्यान कोरड्या फिल्टर केलेल्या हवेने शुद्ध केला जातो.सोल्युशन्स (स्पेक्ट्रामधील पाणी शोषण शिखरे कमी करण्यासाठी 500 mg/mL) क्रिस्टल्सवर पाइपेट केले गेले आणि मोजण्यापूर्वी जेल (500 mg/mL) तयार केले गेले आणि नंतर क्रिस्टल्समध्ये हस्तांतरित केले गेले (n = 3).2 सेमी-1 च्या रिझोल्यूशनसह 1000 स्कॅन रेकॉर्ड केले गेले आणि 2 च्या शून्य ड्युटी सायकल. दुसरा व्युत्पन्न नऊ पॉइंट्सच्या स्मूथिंग रेंजचा वापर करून OPUS (ब्रुकर) वापरून गणना केली गेली.F. Menges “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software” वापरून 1720 आणि 1580 cm-1 मधील समान एकीकरण क्षेत्रामध्ये स्पेक्ट्राचे सामान्यीकरण करण्यात आले.एटीआर-आयआर स्पेक्ट्रोस्कोपीमध्ये, नमुन्यामध्ये इन्फ्रारेड बीमची प्रवेशाची खोली वेव्हनंबरवर अवलंबून असते, परिणामी उच्च वेव्हनंबर्सपेक्षा कमी वेव्हनंबर्सवर अधिक मजबूत शोषण होते.अंजीर मध्ये दर्शविलेल्या स्पेक्ट्रासाठी हे प्रभाव दुरुस्त केलेले नाहीत.3 कारण ते खूप लहान आहेत (पूरक चित्र 4).या आकृतीसाठी योग्य स्पेक्ट्राची गणना ब्रुकर ओपस सॉफ्टवेअर वापरून केली गेली.
तत्वतः, अमाइड I शिखराच्या आत असलेल्या घटकांच्या विश्वासार्ह डीकॉनव्होल्यूशननंतर प्रथिने रचनांचे सर्वसमावेशक परिमाण शक्य आहे.मात्र, व्यवहारात काही अडथळे येतात.स्पेक्ट्रममधील आवाज डीकॉनव्होल्यूशन दरम्यान (खोटे) शिखर म्हणून दिसू शकतो.याव्यतिरिक्त, पाण्याच्या झुकण्यामुळे शिखर हे एमाइड I शिखराच्या स्थितीशी एकरूप आहे आणि मोठ्या प्रमाणात पाणी असलेल्या नमुन्यांसाठी समान परिमाण असू शकते, जसे की येथे अभ्यास केलेल्या जलीय जेल.म्हणून, आम्ही अमाइड I शिखर पूर्णपणे विघटित करण्याचा प्रयत्न केला नाही आणि आमची निरीक्षणे फक्त NMR स्पेक्ट्रोस्कोपीसारख्या इतर पद्धतींच्या समर्थनार्थ विचारात घेतली पाहिजेत.
50 mg/ml NT आणि His-NT2RepCT ची द्रावणे 37°C वर रात्रभर जेल केली गेली.हायड्रोजेल नंतर 20 मिमी ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8) सह 12.5 मिलीग्राम/मिली एकाग्रतेत पातळ केले गेले, चांगले हलवले गेले आणि जेल तोडण्यासाठी पाइपेट केले गेले.पुढे, हायड्रोजेल 20 मिमी ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8) सह 10 वेळा पातळ केले गेले, 5 μl नमुना फॉर्मवर लेपित कॉपर ग्रिडवर लागू केला गेला आणि जास्तीचा नमुना ब्लॉटिंग पेपरने काढला गेला.नमुने 5 µl मिलीक्यू पाण्याने दोनदा धुतले गेले आणि 1% युरेनिल फॉर्मेटने 5 मिनिटांसाठी डाग केले गेले.शोषक कागदासह जादा डाग काढा, नंतर जाळी हवा कोरडी करा.100 kV वर कार्यरत FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN वापरून या ग्रिड्सवर इमेजिंग केले गेले.Veleta 2k × 2k CCD कॅमेरा (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germany) वापरून x 26,500 आणि x 43,000 मॅग्निफिकेशनमध्ये प्रतिमा रेकॉर्ड केल्या गेल्या.प्रत्येक नमुन्यासाठी (n = 1), 10-15 प्रतिमा रेकॉर्ड केल्या गेल्या.इमेजजे (https://imagej.nih.gov/) इमेज विश्लेषण आणि फायबर व्यास (n = 100, भिन्न तंतू) च्या मोजमापासाठी वापरली गेली.प्रिझम 9 न जोडलेल्या टी-चाचण्या (दोन-पुच्छ) करण्यासाठी वापरला गेला.सरासरी His-NT2RepCT आणि NT फायब्रिल्स अनुक्रमे 11.43 (SD 2.035) आणि 7.67 (SD 1.389) nm होते.आत्मविश्वास मध्यांतर (95%) -4.246 ते -3.275 आहे.स्वातंत्र्याची डिग्री = 198, p <0.0001.
कॉर्निंग 96-वेल ब्लॅक बॉटम क्लिअर बॉटम प्लेट्स (कॉर्निंग ग्लास 3881, यूएसए) वापरून स्थिर परिस्थितीत 10 μM थायोफ्लेविन T (ThT) असलेले 80 μl द्रव नमुने ट्रिपलीकेट (n = 3) मध्ये मोजले गेले.440 nm उत्तेजित फिल्टर आणि 480 nm उत्सर्जन फिल्टर (BMG Labtech, Offenburg, Germany कडून FLUOStar Galaxy) वापरून फ्लोरोसेन्स फरक रेकॉर्ड केला गेला.ThT सिग्नल संतृप्त किंवा शांत झाला नाही, कारण सिग्नलची तीव्रता न बदलता ThT च्या वेगवेगळ्या एकाग्रतेसह प्रयोग केले गेले.धुके मोजण्यासाठी 360 nm वर शोषकता रेकॉर्ड करा.पेरणीच्या प्रयोगांसाठी, 100 mg/mL gels 37° C वर तयार केले गेले, पुन्हा निलंबित केले गेले आणि 5%, 10%, आणि 20% च्या दाढ गुणोत्तरांवर पेरणीसाठी वापरले गेले.प्रिझम 9 वापरून डेटाचे विश्लेषण केले गेले.
His-NT2RepCT आणि NT चे साठा >100 mg/mL बर्फावर वितळवा आणि 0.22 µm फिल्टरद्वारे फिल्टर करा.Nanodrop वापरून 280 nm वर शोषकता मोजून एकाग्रता मोजली गेली.स्पष्ट तळाशी असलेल्या 96-वेल काळ्या नॉन-बाइंडिंग प्लेट (कॉर्निंग) च्या विहिरींमध्ये, 20 mM Tris-HCl pH 8 मध्ये नमुने 20 mg/ml पर्यंत पातळ केले गेले आणि 5 μM ThT (अंतिम एकाग्रता) मध्ये मिसळले गेले, एकूण नमुना एकाग्रता 50 μl व्हॉल्यूम.प्रसारित प्रकाश चॅनेल आणि FITC उत्तेजना आणि ThT इमेजिंगसाठी उत्सर्जन फिल्टर सेटसह सेलऑब्झर्व्हर (Zeiss) मायक्रोस्कोपवर दर 10 मिनिटांनी 37 °C वर नमुने प्रतिमा काढल्या गेल्या.इमेजिंगसाठी 20x/0.4 लेन्स वापरली जाते.झेन ब्लू (झीस) आणि इमेजजे (https://imagej.nih.gov/) प्रतिमा विश्लेषणासाठी वापरले गेले.NT आणि His-NT2RepCT सोल्यूशन्समधून 50 mg/mL च्या एकाग्रतेमध्ये 20 mM Tris pH 8 आणि 5 µM ThT असलेल्या एकाग्रतेवर जेल देखील तयार केले गेले आणि 90 मिनिटांसाठी 37°C वर उबवले गेले.जेलचे तुकडे 20 mM Tris, pH 8, आणि 5 μM ThT असलेल्या नवीन विहिरीमध्ये नॉन-बाइंडिंग ब्लॅक 96 वेल क्लिअर तळाच्या प्लेटमध्ये हस्तांतरित केले गेले.20x/0.4 मॅग्निफिकेशनवर ग्रीन फ्लोरोसेन्स आणि चमकदार फील्ड प्रतिमा मिळवा.इमेजजे प्रतिमा विश्लेषणासाठी वापरली गेली.
सोल्यूशन NMR स्पेक्ट्रा 600 MHz Bruker Avance Neo स्पेक्ट्रोमीटरवर 310 K वर QCI क्वाड्रुपोल रेझोनान्स पल्स्ड ग्रेडियंट फील्ड क्रायोप्रोब (HFCN) ने प्राप्त केले.13C, 15N लेबल असलेले 10 mg/mL एकसंध प्रथिने असलेले NMR नमुने, 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) मध्ये विरघळलेले. .15N-HSQC च्या 2D स्पेक्ट्रममध्ये पीक 23 नियुक्त करण्यासाठी pH 6.7 वर NT2RepCT चे रासायनिक शिफ्ट वापरले गेले.
3.2 मिमी 13C/15N{1H} इलेक्ट्रॉनलेस प्रोबसह सुसज्ज असलेल्या 800 मेगाहर्ट्झवर ब्रुकर अव्हान्स III एचडी स्पेक्ट्रोमीटरवर 13C, 15N-लेबलयुक्त हायड्रोजेलचे मॅजिक अँगल स्पिनिंग सॉलिड NMR (MAS) स्पेक्ट्रा रेकॉर्ड केले गेले.नमुना तापमान 277 K वर परिवर्तनीय तापमान वायू प्रवाह वापरून नियंत्रित केले गेले. द्विमितीय द्विध्रुवीय रोटेशनल रेझोनान्स (DARR)76 आणि रेडिओ फ्रिक्वेन्सी रीकनेक्शन (RFDR)77 स्पेक्ट्रा अनुक्रमे 12.5 kHz आणि 20 kHz च्या MAS फ्रिक्वेन्सीवर अधिग्रहित केले गेले.1H ते 13C पर्यंत क्रॉस ध्रुवीकरण (CP) 60.0 ते 48.0 kHz पर्यंत 1H वर रेखीय रॅम्प, 13C वर 61.3/71.6 kHz (12.5/20 kHz MAS वर) आणि संपर्क वेळ 0.5-1 ms वापरून केले गेले.डेटा संकलनादरम्यान 73.5 kHz वर स्पाइनल6478 डीकपलिंग वापरले गेले.संपादन वेळ 10 मिलीसेकंद आणि सायकल विलंब 2.5 सेकंद होता.RFDR स्पेक्ट्रामध्ये पाहिलेले सिंगल-लिंक केलेले Cα/Cβ सहसंबंध वैशिष्ट्यपूर्ण अवशेष-प्रकार रासायनिक शिफ्ट आणि DARR स्पेक्ट्रामधील गुणाकार-लिंक केलेल्या सहसंबंधांवर आधारित नियुक्त केले गेले.
Zipper79 डेटाबेस (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) चा वापर NT, NTFlSp आणि NTMiSp साठी फडफडण्याच्या प्रवृत्ती आणि रोसेटा उर्जेचे मूल्यांकन करण्यासाठी केला गेला.जिपर डेटाबेस Rosetta Energy80 ची गणना करते, जे प्रथिन संरचनेचे मॉडेल आणि विश्लेषण करण्यासाठी अनेक मुक्त ऊर्जा कार्ये एकत्र करते.-23 kcal/mol किंवा त्याहून कमी ऊर्जा पातळी फायब्रिलेटची उच्च प्रवृत्ती दर्शवते.कमी ऊर्जेचा अर्थ जिपर कॉन्फॉर्मेशनमधील दोन β-स्ट्रँडची अधिक स्थिरता.याव्यतिरिक्त, NT, NTFlSp आणि NTMiSp रेफ मधील amyloidogenic प्रदेशांचा अंदाज लावण्यासाठी वॉल्ट्झ अल्गोरिदमचा वापर केला गेला.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT प्रोटीन द्रावण 2-(N-morpholino)इथेनेसल्फोनिक ऍसिड (MES) बफरमध्ये pH 5.5 आणि 6.0 वर मिसळून pH अनुक्रमे pH 6 आणि 7 पर्यंत कमी केले.अंतिम प्रोटीन एकाग्रता 100 mg/ml होती.
J-1500 CD स्पेक्ट्रोमीटर (JASCO, USA) वर 0.1 सेमीच्या ऑप्टिकल मार्गासह 300 μL क्युवेट वापरून मोजमाप केले गेले.20 मिमी फॉस्फेट बफर (पीएच 8) मध्ये प्रथिने 10 μM (n = 1) पर्यंत पातळ केली गेली.मिठाच्या उपस्थितीत प्रथिनांच्या स्थिरतेचे विश्लेषण करण्यासाठी, अनुक्रमे 154 mM NaF किंवा NaCl असलेल्या 20 mM फॉस्फेट बफर (pH 8) मध्ये समान एकाग्रता (n = 1) मध्ये प्रथिनांचे विश्लेषण केले गेले.तापमान स्कॅन 222 nm वर 25°C ते 95°C पर्यंत 1°C/min च्या गरम दराने नोंदवले गेले.मूळ दुमडलेल्या प्रथिनांचे प्रमाण सूत्र (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal) वापरून मोजले गेले.याशिवाय, प्रत्येक नमुन्यासाठी 260 nm ते 190 nm पर्यंत 25°C वर आणि 95°C पर्यंत गरम केल्यानंतर पाच स्पेक्ट्राची नोंद केली गेली.पाच स्पेक्ट्रा सरासरी, गुळगुळीत आणि मोलर लंबवर्तुळात रूपांतरित केले गेले.प्रिझम 9 वापरून डेटाचे विश्लेषण केले गेले.
His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) ची फ्लूरोसेन्स तीव्रता स्थिर परिस्थितीत काळ्या पारदर्शक तळाशी (कॉर्निंग ग्लास 3881, USA) असलेल्या 96-वेल कॉर्निंग प्लेट्समध्ये तिप्पट (n = 3) मध्ये मोजली गेली.फ्लूरोसेन्स-आधारित प्लेट रीडरसह 395 nm च्या उत्तेजित तरंगलांबीसह नमुने मोजा आणि उत्सर्जन 509 nm वर जळण्यापूर्वी आणि 2 तासांनंतर 37°C वर नोंदवा.प्रिझम 9 सह डेटाचे विश्लेषण केले गेले.
निर्मात्याच्या सूचनेनुसार प्युरिन न्यूक्लिओसाइड फॉस्फोरिलेस ऍक्टिव्हिटी परख किट (फ्लोरोमेट्रिक पद्धत, सिग्मा अल्ड्रिच) वापरली गेली.हिस-एनटी-पीएनपी असलेल्या जेल आणि सोल्यूशन्समधील क्रियाकलाप मोजण्यासाठी, 10 एनजी हिस-एनटी-पीएनपी 100 मिलीग्राम/एमएल एनटी 2 μL च्या एकूण व्हॉल्यूममध्ये मिसळा कारण जेलने सेटच्या डिटेक्शन इंटरव्हलच्या वर एक सिग्नल दिला आहे.हिज-एनटी-पीएनपीशिवाय जेल आणि सोल्यूशन्ससाठी नियंत्रणे समाविष्ट केली गेली.मोजमाप दोनदा केले गेले (n = 2).क्रियाकलाप मोजल्यानंतर, प्रतिक्रिया मिश्रण काढून टाकले गेले आणि मापन दरम्यान जेल अखंड राहील याची खात्री करण्यासाठी जेलचे छायाचित्र काढले.प्रिझम 9 वापरून डेटाचे विश्लेषण केले गेले.
अभ्यासाच्या रचनेबद्दल अधिक माहितीसाठी, या लेखाशी जोडलेला निसर्ग अभ्यास गोषवारा पहा.
आकडे 1 आणि 2 प्रारंभिक डेटा सादर करतात.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, आणि 6, पूरक अंजीर.3, पूरक अंजीर.5a, d, पूरक अंजीर.6 आणि पूरक अंजीर.8. या अभ्यासातील डेटा डेटा झेनोडो डेटाबेस https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653 मध्ये होस्ट केला आहे.या अभ्यासात प्राप्त केलेला NMR डेटा BMRBig रेपॉजिटरीमध्ये एंट्री आयडी bmrbig36 अंतर्गत पोस्ट केला गेला.GFP आणि PNP ची रचना PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2) वरून घेतली गेली.
रायझिंग, ए. आणि जोहानसन, जे. स्पिनिंग आर्टिफिशियल स्पायडर सिल्क.राष्ट्रीय रसायन.जीवशास्त्र11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Nephila clavipes जीनोम स्पायडर सिल्क जनुकांची विविधता आणि त्यांची जटिल अभिव्यक्ती हायलाइट करते.राष्ट्रीय जेनेट.४९, ८९५–९०३ (२०१७).